基于合成生物学的微生物制造研究进展

基于合成生物学的微生物制造在天然产物药物、生物能源、生物基化学品及生物传感器件的研究中发挥越来越重要的作用。本文系统地介绍了合成生物学研究领域的最新技术进展，包括DNA和染色体合成、新生物元件开发与元件库标准化、染色体工程与最小基因组技术、途径装配技术等，并阐述了合成生物学在微生物制造领域内所取得的突破和巨大的应用价值。

黄海海域沉积物和庐山土壤样品中放线菌的分离、活性及生物多样性研究

本研究采用均匀实验设计优化预处理条件来分离黄海海泥和庐山土壤样品中的放线菌。通过均匀实验得到最优的预处理条件为湿热50℃处理20 min,不进行超声处理以及添加苯酚。经过形态排重后,从海泥和庐山样品中分离得到86株和11株不同表型的放线菌。通过进一步的分子生物学鉴定,海泥中的86株放线菌分别属于3个不同的属,而庐山样品的11株分别属于4个不同的属。对这97株放线菌进行抗菌实验发现,18.5%的菌株对大肠杆菌有抑菌活性,7.2%的菌株对枯草芽孢杆菌有抑菌活性,但对酿酒酵母都无抑菌活性。

基于系统-合成生物学的人工细胞网络设计

在过去的十多年里，研究人员利用合成生物学方法在模式微生物底盘中设计和重建了一系列重要天然化合物的异源合成模块，大大拓展了微生物发酵在珍稀药物、食品添加剂、生物能源和精细化学品生产领域的应用价值。为了实现异源产物的高产量和高得率，必须综合运用系统生物学和合成生物学方法，对异源模块进行优化设计，强化底盘细胞的前体和能量合成，并改善模块的适配性，最终实现异源化合物的高产。文章综述了近年来在人工细胞网络设计上的进展。

禾长蠕孢菌稗草专化型固体发酵产孢培养基及其工艺条件的研究

禾长蠕孢菌稗草专化型(Helminthosporium gramineum Rabenh. f. sp. echinochloae,HGE)是一株稗草生防潜力菌,为了获得该生防菌大量孢子用于田间试验,本文研究了其固体发酵产孢最佳培养基配方及其培养条件。通过试验筛选确定了固体发酵培养基所需碳源及其浓度、氮源及其浓度以及底物基质,适合HGE菌孢子生产的培养基最佳组合为:以珍珠岩为底物基质,在其中添加4%米粉、1%豆粕粉、0.2%Na3PO4.12H2O、0.1%MgSO4.7H2O。同时确定了适合HGE菌孢子生产的培养条件:培养基最适含水量为40%,最佳接菌量为8%菌悬液,25℃静置培养11 d,培养期间用黑光灯12 h循环光照。按优化后培养条件放大培养HGE菌,获得最高产孢量可以达到1.5×107孢子·克-1干物质。温室生测结果显示优化条件生产的HGE菌孢子对稗草防效可达80%以上。

合成、重构和改造微生物基因组

合成生物学是生物科学领域住21世纪刚刚出现的一个新的分支学科，作为一门新兴的交叉学科，与传统生物学通过解剖生命体以研究其内在构造的办法不同，合成生物学的研究方向是从最基本的要素开始一步步建立零部件。与基因工程把一个物种的基因延续、改变并转移至另一物种的作法不同，合成生物学的目的在于建立人工生物体系，让它们像电路一样运行。

3种药用植物内生真菌的多样性分析及产生物碱菌株的筛选

目的探究药用植物蛇足石杉、曼地亚红豆杉和南方红豆杉内生真菌的多样性,以及从中筛选产生物碱的内生真菌。方法用传统的表面灭菌和组织剪切法处理植物样品,通过加有抗细菌抗生素的真菌培养基分离和富集植物内生真菌。根据内生真菌的表型特征和ITS序列,对其进行分类和多样性分析,并用Neighbour-Joining的方法构建系统进化树。利用Dragendorff试验检测各内生真菌的发酵液,筛选具有产生物碱潜力的菌株。结果从3种植物中共分离到764株内生真菌,挑选出具有代表性表型特征的菌株83株,对ITS序列进行比对和多样性分析表明,这些菌株分布于子囊菌门(Ascomycota)的3个纲、18个属。最后,采用Dragendorff试验从这83株真菌中筛选出青霉菌属(Penicillium)B14菌株具有产生物碱的潜力。讨论三种药用植物含有丰富多样的内生真菌分布。采用Dragendorff试验检测发酵液中的生物碱,该方法快速简便,能有效提高筛选速率,可应用于产生物碱微生物的高通量筛选。

利用基因工程定向阻断尼莫克汀工业生产菌株中多个杂质组份的生物合成

目的通过基因工程定向改造尼莫克汀(nemadectin)产生菌蓝灰链霉菌(Streptomyces cyaneogriseus subsp.noncyanogenus),以阻断除主要杂质组分合成,提高有效组分产量。方法通过构建和筛选蓝灰链霉菌的基因组文库,获得了与LL-F28249ω合成相关的基因nolB。在蓝灰链霉菌的工业生产菌株NS1-8中连续删除尼莫克汀合成途径的nemD基因和类似寡霉素合成途径的nolB基因,获得了突变株NM-10。结果发酵检测产物表明,NM-10突变株产生活性组分LL-F28249α产量(1312mg/L)高于出发工业菌株NS1-8(1030mg/L),且不再产生LL-F28249γ、LL-F28249λ和LL-F28249ω等3个结构类似的杂质组份。结论 nemD和nolB基因连续敲除可用于改造产尼莫克汀蓝灰链霉菌工业产生菌,降低非有效组分含量并提高产量。

合成生物学技术的研究进展——DNA合成、组装与基因组编辑

合成生物学作为一门新兴学科,其目标主要有两点:一是利用非天然的分子使其出现生命的现象,也就是―人造生命‖;二是―改造生命‖,比如利用一种生命体的元件(或经过人工改造),组装到另一个生命体中,使其产生特定功能。无论是哪种目的,对生命遗传物质DNA的操作都非常关键,其具体包括DNA的从头合成、组装和编辑等。同时,这些使能技术的进步也促进了合成生物学其他领域的发展。本文介绍了DNA操作相关的合成生物学使能技术的最新进展。

从87种中草药植物中分离内生放线菌及其规律的初探

为了考察从植物中分离内生放线菌的规律,采集了87种中草药植物,包括62种草本植物和25种木本植物。减少系统误差后的统计数据显示,从55种草本植物和13种木本植物中各分离和初步鉴定了519株和41株内生放线菌,暗示从大多数草本植物比从木本植物中分离到内生放线菌的概率大。通过比较不同植物组织的出菌率,发现不论是草本还是木本植物,植物的地上部分(茎和叶)分离到的内生放线菌的数量比地下根部的多。这些初步的分离规律对于今后从中草药植物中高效地分离内生放线菌提供了借鉴意义。

利用合成多位点突变aveC*基因提高多拉菌素工业菌株中有效活性组份的含量

目的合成多位点突变的aveC*基因用于提高除虫链霉菌工业菌株产生多拉菌素(CHC-B1)组份的含量。方法利用相互重叠的引物进行PCR扩增,合成多位点突变的aveC*基因。利用PCR打靶技术获得aveC*基因发生置换的突变株。结果用32条引物进行PCR扩增,获得了10个位点突变的aveC*基因。构建了打靶载体pFX-HA,在基因组上将aveC基因原位替换成了aveC*基因。所获得的突变株LF2发酵产生多拉菌素组份的纯度由出发菌株的25%提高到93%,发酵效价达到691.5mg/L。结论除虫链霉菌工业菌株基因组中原位替换的多位点突变的aveC*基因可以大幅度提高多拉菌素组份的含量,降低工业提取纯化的成本。

海洋微生物来源的天然产物开发研究进展

综述了近年来海洋微生物来源天然产物研究的新进展,总结了该类天然产物的开发策略.通过对样品采用不同的预处理方式、不同的分离培养基以及新的培养方法,讨论如何获得海洋来源的特有微生物和增加海洋来源微生物类群的多样性.阐述了在海洋微生物天然产物的开发过程中,采用宏基因组技术及基因组测序等手段,来发现难培养或不可培养微生物中的天然产物以及处于"沉默"状态的天然产物.最后介绍了异源生物合成、组合生物合成以及核糖体工程等技术在海洋微生物天然产物开发和改造中的应用,并举例论述了海洋微生物天然产物的开发.

合成生物学伦理、法律与社会问题探讨

合成生物学是以基因组学、系统生物学知识和分子生物学技术为基础,综合了科学与工程的一门新兴交叉学科。它使生命科学和生物技术研发进入了以人工设计、合成自然界中原本不曾出现的人造生命体系,以及对这些人工体系进行体内、体外优化,或利用这些人造生命体系研究自然生命规律为目标的新时代。然而,合成生物学研究在迅速发展、表现出巨大潜力和应用前景的同时,也引发了社会各界对相关社会、伦理、安全,以及知识产权等问题的重视与讨论。就世界各国针对合成生命对传统意义上生命概念的挑战、合成生物学产品存在的潜在风险危害、合成生物学研究的风险评估与监管等问题进行回顾综述和相关探讨。

合成生物学与天然产物开发

天然产物依然是临床用药的重要来源。合成生物学的诞生为天然产物的开发提供了全新的机遇,传统的微生物药物、植物天然产物等研究领域都因合成生物学而获得新生。重点介绍了合成生物学在天然产物开发中的应用,包括新化合物及其生物合成元件的筛选,基于理性设计的天然产物异源生物合成,人工底盘细胞的系统优化等。

构建有序排列的除虫链霉菌基因组的柯斯文库用于工业生产菌株的遗传改造

以容纳DNA大片段的柯斯质粒Supercos-1为载体,构建了除虫链霉菌的基因组文库。对约1000个柯斯质粒上插入片段的两端进行测序,并利用全基因组序列的信息,构建了覆盖约91%基因组的有序排列的柯斯文库。利用λ-Red高效DNA重组和大肠埃希菌-链霉菌接合转移技术,建立了除虫链霉菌的基因组遗传操作系统。运用该系统可以在除虫链霉菌工业菌株中进行高效、精确的基因敲除工作和连续的基因缺失研究,获得可以用来生产多拉菌素的工程菌株。

除虫链霉菌10个聚酮类抗生素生物合成基因簇的敲除对阿维菌素产量的影响

【目的】考察除虫链霉菌基因组中其它聚酮合成酶类(Polyketide synthase,PKS)抗生素生物合成基因簇的敲除突变对于阿维菌素产量的影响。【方法】构建了11个PKS基因簇的打靶Cosmid和质粒载体,导入除虫链霉菌中筛选突变株。【结果】在工业菌株MMR630中成功敲除了10个PKS基因簇。发酵结果显示7个PKS基因簇敲除突变株中阿维菌素的产量均有不同程度的提高,而2个突变株不能产生阿维菌素。然而,在3个连续敲除2个PKS基因簇的突变株中阿维菌素产量没有能够超过单个PKS敲除突变株的提升幅度。【结论】除虫链霉菌基因组的一些PKS基因簇的敲除可以提高阿维菌素的产量,同时暗示同一类次生代谢产物的代谢流之间存在复杂的相互作用关系。

海洋细菌中活性化合物的筛选策略(英文)

目的从700多株海洋沉积物分离得到的细菌中筛选安莎类抗生素和6-脱氧己糖(6DOH)糖基化修饰的次级代谢产物产生菌。方法以3-氨基-5-羟基苯甲酸(AHBA)合酶基因和dTDP-葡萄糖-4,6-脱水酶基因为靶标,分别进行安莎类抗生素和6DOH糖基化修饰的次级代谢产物产生菌的分子筛选。对AHBA合酶及dTDP-葡萄糖-4,6-脱水酶基因阳性的菌株发酵液及提取物进行抗菌、抗肿瘤、抗病毒活性分析。采用利福霉素抗性及氢氧化钠显色初步鉴定安莎类化合物;采用α-萘酚硫酸显色初步鉴定6DOH糖基化修饰的化合物。利用16S rRNA序列对部分阳性菌株进行系统发育分析。结果共获得39株AHBA合酶基因阳性和10株dTDP-葡萄糖-4,6-脱水酶基因阳性菌株。阳性菌株中,78%具有不同程度的生物活性。化学初步鉴定结果表明:49%的AHBA合酶基因阳性菌株产生安莎类化合物;50%的dTDP-葡萄糖-4,6-脱水酶基因阳性菌株产生6DOH糖基化修饰的化合物。系统发育分析表明,大多数阳性菌株属于放线菌中的链霉菌属。结论基因探针筛选可作为一种合理、有效的方法从海洋细菌中发现活性代谢产物。

复杂天然产物合成人工生物系统的设计与构建

天然产物是人类疾病预防和治疗药物的最重要来源。合成生物学技术的蓬勃发展为天然产物的开发注入了全新的活力。文中重点介绍了如何利用合成生物技术进行复杂天然产物合成人工生物系统的设计与构建,包括与此相关的生物元件理性设计、生物元件挖掘、途径装配与集成,模块的组装与系统的适配等内容。

一种发酵提取物中含卤有机化合物的早期鉴别方法

目的建立一种对发酵提取物中含卤有机化合物的快速定性检测方法。方法以改良的Beilsten法对含卤和不含卤的有机化合物纯品及发酵液提取物进行焰色反应,观察是否有阳性现象——绿色火焰呈现;同时研究了该法的检测基限和氯化钠对检测的干扰。结论改良的Beilsten法适用于对含氯、溴、碘元素有机物的定性检测,其对卤元素的检测基限可达到微克级;通过适当的发酵液提取方式降低无机卤素的干扰后,该法可有效检测发酵提取物中含卤有机化合物。

遗传改造刺糖多孢菌菌株生产多杀菌素J和L

目的发展刺糖多孢菌遗传操作体系,构建生产多杀菌素J和L遗传重组菌株。方法由于刺糖多孢菌是公认的难操作放线菌之一,本文通过λ-Red和FLP重组酶介导的体内重组体系结合黏粒文库,发展了刺糖多孢菌的高效基因操作体系。结果利用该方法实现目标基因高效敲除,测试基因敲除效率可达66%。利用该技术构建了SpnK失活的刺糖多孢菌突变菌株,HPLCMS和NMR分析显示突变株产生的新化合物为多杀菌素J和L,且产量与出发菌株产生的多杀菌素A和D相当。结论该策略可用于刺糖多孢菌的遗传改造,可将多杀菌素高产菌株改造后直接生产多杀菌素J和L。

DNA组装新方法的研究进展

2010年,蕈状支原体Mycoplasma mycoides的人工合成,迎来了合成生物学的崭新时代。这种突破性的进展主要得益于酵母自身强大的DNA体内重组能力。近几年来,除了利用体内重组的DNA大片段拼接技术,基于连接或聚合思想的不同尺度的DNA体外组装方法也相继出现,如Biobrick\Bglbrick、SLIC与Gibson等温一步法等,这些方法的应用加快了合成生物学功能元件库、生物合成途径乃至微生物染色体的人工构建。事实上,目前所建立的各种DNA组装方法,均是由DNA分子拼接理念(包括两分子衔接思想与多片段组装模式)衍生而来。文中将在介绍DNA组装基本理念的基础上,对体内、体外主要的DNA组装方法进行简要梳理,希望为不同类型的合成生物学功能器件及生物合成途径的构造提供参考与借鉴。