小分子药物kartogenin保护终板软骨退变的实验研究

目的:研究小分子药物kartogenin(KGN)对终板软骨组织细胞外基质分泌的影响,探讨其在终板软骨以及椎间盘退变中的作用。方法:建立大鼠椎间盘体外器官退变模型,分为对照组、退变组(穿刺注射生理盐水)、KGN处理组(穿刺注射100nmol/L KGN),利用HE染色观察终板软骨及椎间盘形态,番红-固绿染色观察终板软骨细胞外基质的分泌。通过Real time-PCR评价三组终板软骨组织中Ⅱ型胶原、蛋白多糖、SOX-9的表达变化,Western blot检测Ⅱ型胶原、SOX-9蛋白表达变化。结果:HE染色结果显示与对照组比较,退变组椎间盘髓核消失,终板软骨减少,发生明显退变,KGN处理组椎间盘结构较完整;番红-固绿染色可见实验组较对照组终板软骨细胞外基质分泌增多。Realtime-PCR结果显示退变组终板软骨组织Ⅱ型胶原、蛋白聚糖及SOX-9表达明显下调,KGN处理组中终板软骨组织Ⅱ型胶原、蛋白聚糖及SOX-9表达上调;Western blot结果显示实验组软骨细胞中Ⅱ型胶原、SOX-9蛋白表达明显增高。结论:体外穿刺及培养能够诱导椎间盘及终板软骨的退变,小分子药物KGN能够促进终板软骨细胞外基质的分泌从而保护终板软骨及椎间盘的退变。

淫羊藿素通过抑制Hedgehog信号通路保护终板软骨细胞退变

目的:探讨淫羊藿素药物在体外力学诱导终板软骨细胞退变中的作用机制。方法:应用FX-5000T flexcell细胞应力加载系统体外建立大鼠终板软骨细胞退变模型,实验分正常对照组(NC组)、力学刺激组(ICMT组)、力学刺激+药物处理组(ICT+ICMT组)。甲苯胺蓝及鬼笔环肽染色观察力学刺激后细胞形态变化,CCK-8法和流式细胞术检测细胞增殖与凋亡,Western blot及RT-q PCR分别检测软骨细胞相关基因及蛋白水平变化。结果:大鼠终板软骨细胞力学刺激后出现退变,细胞形态由多边形被拉成长梭形,ICMT组、ICT+ICMT组细胞增殖率均高于NC组,但ICMT组与ICT+ICMT组间细胞增殖率比较无统计学差异,ICT+ICMT组细胞凋亡率较ICMT组明显改善,加入淫羊藿素药物处理后终板软骨细胞因力学刺激导致的退变程度有所缓解,Hedgehog信号通路被抑制。结论:淫羊藿素药物可通过抑制Hedgehog信号通路活性起到保护因力学诱导而引起的终板软骨细胞退变作用。

中药胡椒碱在终板软骨细胞退变中的保护作用的研究

目的:探讨中药胡椒碱对椎间盘终板软骨细胞退变的保护作用。方法:分离获取大鼠终板软骨细胞,体外培养建立终板软骨细胞加力退变模型。设空白对照组(未加力细胞)、加力组(10%间歇性循环牵张力,10%ICMT,0.5 Hz,8 h/d,加力3 d)及加力加药物组(加力组中加入中药胡椒碱40μmol/L)。倒置相差显微镜观察细胞形态学变化,甲苯胺蓝染色鉴定细胞表型。实时聚合酶链反应检测各组细胞中SOX-9基因,II型胶原,蛋白聚糖,MMP13的表达情况,核质分离及免疫印迹检测胞核与胞质中NF-κB信号通路相关蛋白P65、p-P65表达变化。结果:细胞体外加力后表型丢失,甲苯胺蓝染色可见细胞外基质减少,加力加药组细胞外基质未见明显减少。加力组细胞(ICMT)较空白对照组细胞(NC组)SOX-9(ICMT/NC=0.22,P<0.01)、蛋白聚糖(ICMT/NC=0.15,P<0.01)、II型胶原(ICMT/NC=0.18,P<0.01)表达明显降低,NF-κB信号通路相关基因P65入核增加,NF-κB信号通路相关基因MMP13(ICMT/NC=1.68,P<0.05)表达明显上升。40μmol/L胡椒碱处理的加力加药组较加力组细胞核内p-P65减少,NF-κB信号通路相关基因MMP13(40μmol/L胡椒碱/ICMT=0.70,P<0.05)表达降低,40μmol/L胡椒碱处理的加药加力组中II型胶原(40μmol/L胡椒碱/ICMT=1.93,P<0.05)、蛋白聚糖(40μmol/L胡椒碱/ICMT=1.78,P<0.05)、SOX-9(40μmol/L胡椒碱/ICMT=1.70,P<0.05)等基因表达明显回升。结论:中药胡椒碱可以抑制椎间盘终板软骨细胞的退变发生,从而起到对椎间盘及终板软骨的保护作用。

小分子药物TD-198946对终板软骨退变具有保护作用

目的:探讨小分子药物TD-198946对椎间盘退变及终板软骨退变保护作用。方法:通过建立体外的大鼠整体椎间盘组织退变模型,分为对照组、退变组(椎间盘内注射20μL生理盐水)及药物处理组(椎间盘内穿刺注射100 nmol/L TD-198946),通过HE、番红-快绿染色方法观察椎间盘及终板软骨形态变化,以及番红-固绿染色分析终板软骨细胞外基质的分泌状况。利用RT-PCR以及Western blot(免疫印迹)法研究三组终板软骨组织中的相关的软骨表型基因II型胶原、SOX9、蛋白聚糖的基因和蛋白表达变化。结果:HE结果显示,相对于对照组的结果,退变组椎间盘内髓核及纤维环几乎消失,终板软骨的细胞数量明显减少。TD-198946处理组椎间盘组织整体结构相对完整,软骨细胞数量增加;番红-快绿染色可发现药物处理组相对于退变组其软骨细胞的细胞外基质分泌明显增多。RT-PCR结果显示相对于对照组,退变组终板软骨内相关表型基因二型胶原、SOX9、蛋白聚糖表达明显减少,而TD-198946处理组终板软骨内相关基因较退变组表达则明显上调。Western blot的实验结果与上述结果一致。结论:小分子药物TD-198946可以抑制椎间盘组织及终板软骨细胞的退变发生,从而起到对椎间盘及终板软骨的保护作用。

HIF-1α和COX-2在力学诱导大鼠终板软骨细胞退变模型中的表达及意义

目的:探讨缺氧诱导因子1α(HIF-1α)和环氧化酶2(COX-2)在间歇性循环牵张力作用下诱导大鼠终板软骨细胞退变中的表达情况及意义.方法:应用胰酶消化法获得大鼠终板软骨细胞,用FX-5000T仪器给予终板软骨细胞施加10%牵张力、0.5Hz、8h/d的力学刺激诱导终板软骨细胞退变,实验中设对照组(无力学刺激)和实验组(10%、0.5Hz、8h/d力学刺激),甲苯胺蓝染色观察细胞形态及二型胶原分泌情况,RT-PCR及Western blotting分别检测软骨细胞中HIF-1α、COX-2的m RNA和蛋白水平变化.结果:大鼠终板软骨细胞给予一定力学刺激后出现退变改变,软骨相关合成基因表达水平降低,实验组中HIF-1α、COX-2的m RNA及蛋白水平表达均较对照组增高,差异具有统计学意义(P<0.05).结论:HIF-1α、COX-2在力学诱导大鼠终板软骨细胞退变模型中表达水平均增高,进一步推测其与椎间盘退变过程有关.

miR-125a-5p在大鼠终板软骨细胞自然退变中的表达及其靶基因预测

目的:通过建立体外大鼠终板软骨细胞自然退变模型,探讨miR-125a-5p在自然传代诱导大鼠终板软骨细胞退变中的表达,通过生物信息学软件预测相关靶基因.方法:取大鼠原代终板软骨细胞,应用胰酶消化法和自然传代法培养终板软骨细胞,分别选取P2、P5、P8代细胞进行甲苯胺蓝及阿辛蓝染色观察细胞形态改变.qRT-PCR检测终板软骨细胞中miR-125a-5p表达情况,通过生物信息学软件预测相关靶基因.结果:细胞传到P5代时细胞由多角形变成长梭形,外基质分泌减少,细胞形态发生退变改变,qRT-PCR检测结果显示mi R-125a-5p表达含量随细胞代数增加逐渐减少.结论:大鼠终板软骨细胞自然传代至P5代出现退变改变,miR-125a-5p与终板软骨退变有密切联系.

淫羊藿素药物在终板软骨细胞退变中的保护作用研究

目的:探讨淫羊藿素药物对张力诱导下终板软骨细胞退变的保护作用.方法:分离获取大鼠终板软骨细胞,体外培养建立终板软骨细胞加力退变模型.设对照组(未加力的终板软骨细胞,NC组)、加力组(10%间歇性循环牵张力,10%ICMT,0.5Hz,8h/d,加力3天,ICMT组)及加力加药物组(加力组中加入不同浓度中药淫羊藿素,加药+ICMT组).倒置相差显微镜观察细胞形态学变化,甲苯胺蓝染色鉴定细胞表型.MTT法检测大鼠终板软骨细胞的增殖.实时聚合酶链反应及Western blotting检测Ⅱ型胶原(COL2A1)、蛋白多糖(ACAN)及SOX-9基因变化.结果:淫羊藿素在低浓度(<2umol/L)药物范围内对大鼠终板软骨细胞生长无明显毒性作用,较高浓度对细胞生长与增殖有明显的抑制作用.终板软骨细胞体外加力后细胞表型改变,甲苯胺蓝染色可见细胞外基质减少,加药+ICMT组细胞外基质未见明显减少.淫羊藿素药物在一定药物范围内对大鼠终板软骨细胞具有保护作用,抑制细胞软骨细胞退变发生.结论:淫羊藿素通过抑制椎间盘终板软骨细胞退变的发生,进而起到保护终板软骨的作用.

骨保护素保护关节软骨细胞作用机制研究

目的探讨骨保护素(OPG)对间歇性循环牵张力(ICMT)加力诱导下退变的关节软骨细胞保护作用的机制。方法获取大鼠膝关节软骨细胞,传代至P2代进行实验,对细胞用FX-5000TM细胞体外力学刺激装置进行力学刺激,建立关节软骨细胞体外退变模型。P2代软骨细胞随机分为对照组、ICMT 3 d组(在与对照组相同培养条件下对细胞进行8%压强的ICMT,0.5 Hz,10 h/d,加力3 d)、OPG组(在细胞培养液中加入一定浓度的OPG培养细胞)、ICMT 3 d+OPG组(对用含有OPG的细胞培养液培养的细胞进行加力3 d)。培养3 d后收集各组细胞,应用倒置相差光学显微镜观察关节软骨细胞的表型变化,甲苯胺蓝染色法观察细胞表面形态,四噻唑蓝法检测不同浓度OPG和不同ICMT作用时间下关节软骨细胞存活率的变化。RT-PCR法检测各组关节软骨细胞中二型胶原、蛋白聚糖、SRY相关高迁移率族盒蛋白9(SOX-9)、基质金属蛋白酶13(MMP-13)mRNA表达水平,Western blot法检测各组关节软骨细胞中NF-κB信号通路相关蛋白MMP-13、p65、磷酸化p65(p-p65)蛋白表达水平。结果与对照组比较,ICMT 3 d组细胞发生梭形改变,细胞外基质减少;ICMT 3 d+20 ng OPG组细胞形态变化不明显,细胞外基质的丢失得到改善。ICMT 1 d组、ICMT 2 d组、ICMT 3 d组、5 ng OPG组、10 ng OPG组和20 ng OPG组与对照组关节软骨细胞存活率比较,差异均无统计学意义(均P>0.05)。与对照组比较,ICMT 1 d组、ICMT 3 d组细胞中二型胶原、蛋白聚糖、SOX-9 mRNA表达水平均下降,ICMT 3 d组细胞中MMP-13 mRNA表达水平升高,差异均有统计学意义(均P<0.05)。与ICMT 3 d组比较,ICMT 3 d+10 ng OPG组细胞中二型胶原、SOX-9 mRNA表达水平均升高,ICMT 3 d+20 ng OPG组细胞中二型胶原、蛋白聚糖、SOX-9 mRNA表达水平均升高,ICMT 3 d+10 ng OPG组、ICMT 3 d+20 ng OPG组细胞中MMP-13 mRNA表达水平均下降,差异均有统计学意义(均P<0.05)。与ICMT 3 d组比较,ICMT 3 d+5 ng OPG组、ICMT 3 d+10 ng OPG组、ICMT 3 d+20 ng OPG组MMP-13蛋白表达水平均下降(均P<0.05)。与ICMT 3 d组比较,ICMT 3 d+10 ng OPG组、ICMT 3 d+20 ng OPG组中p-p65蛋白表达水平均下降(均P<0.05)。结论OPG通过影响NF-κB信号通路可以抑制大鼠膝关节软骨细胞的退变,从而起到保护关节软骨的作用。