人牙本质涎磷蛋白成熟肽cDNA的克隆、序列分析和原核表达

目的 克隆人牙本质涎磷蛋白 (DSPP)成熟肽编码区基因片段并进行原核表达 .方法 用异硫氰酸胍一步法从人牙乳头组织中抽提总 RNA,用 Oligo(dt)作引物逆转录合成牙乳头 c DNA,然后利用 PCR法 ,从 c DNA中扩增出人DSPP成熟肽基因片段 (约 6 0 0 bp) ,将所得基因片段插入p Bluescript质粒载体 ,转化到大肠杆菌 XL 1- Blue后挑选阳性克隆 ,提取重组质粒 DNA,通过酶切分析和核苷酸序列分析鉴定阳性克隆 ;将 DSPP基因重组入表达载体 p GEX- 3X中构建表达载体 ,并在大肠杆菌 BL 2 1中进行表达 .结果 酶切图谱和序列分析与国外文献报道一致 ,DSPP蛋白在大肠杆菌中得到表达 .结论 克隆到人 DSPP成熟肽编码区基因片段 ,并在原核中得到表达 ,为进一步研究其功能奠定基础 .

从人软骨提取总RNA和CDMP-1成熟肽片段的克隆

目的克隆人软骨来源形态发生蛋白 - 1(CDMP - 1)成熟肽编码区的基因片段。 方法用异硫氰酸胍一步法从人软骨组织和酶消化法原代培养的软骨细胞中分别抽提总RNA ,利用RT -PCR方法扩增出人CDMP -1成熟区的基因片段 (约 1.0kbp) ,将所得基因片段插入 pBluescript质粒载体 ,重组质粒DNA ,通过酶切分析和核苷酸序列分析鉴定阳性克隆。 结果从软骨组织直接抽取到总RNA ,其质量与从等重量软骨组织中的原代软骨细胞所抽取的基本一致 ,人CDMP - 1酶切图谱正确 ,测序得到的部分序列与基因库公布序列一致。 结论从软骨组织可以直接抽取总RNA ,克隆到人CDMP - 1成熟肽编码区的基因片段。

小鼠牙本质涎磷蛋白成熟蛋白编码区cDNA克隆与部分序列分析

目的 克隆小鼠牙本质涎磷蛋白 (dentinsialophosphoprotein ,DSPP)成熟蛋白编码区基因。方法 用异硫氰酸胍一步法从昆明新生小鼠磨牙牙胚组织中抽提总RNA ,用Oligo(dt)作引物逆转录合成牙胚cDNA ,然后利用PCR方法 ,从cDNA中扩增出小鼠DSPP成熟区的基因片段 (约 3kbp) ,将所得基因片段插入pBluescriptKS质粒载体 ,转化到大肠杆菌XL1 Blue后挑选阳性克隆 ,提取重组质粒DNA ,通过限制性酶切和核苷酸序列分析鉴定阳性克隆。结果 重组质粒pBS DSPP的酶切图谱和部分序列分析结果与国外文献报道一致。结论 克隆到小鼠DSPP成熟编码区基因 ,正在进行该基因的表达和活性鉴定。