IMS-qPCR检测水源性微小隐孢子虫方法的建立

目的将免疫磁珠分离技术(IMS)和荧光探针定量PCR(qPCR)相结合,建立水源性微小隐孢子虫卵囊的检测方法。方法以抗微小隐孢子虫卵囊表面抗原Cp23单克隆抗体包被链霉素磁珠,制备特异免疫磁珠,根据卵囊回收率优化分离和富集卵囊条件。根据微小隐孢子虫核糖体DNA小亚基(18S rDNA)基因(登录号AB513881.1)序列设计引物和荧光标记探针,以分离纯化后的微小隐孢子虫卵囊基因组DNA为模板进行扩增,将扩增产物克隆至Peasy-T1载体。经筛选鉴定后,将重组质粒倍比稀释至104～108copy/μl,荧光探针定量PCR检测,并绘制标准曲线。用荧光探针定量PCR分别检测微小隐孢子虫、贝氏隐孢子虫、刚地弓形虫、犬隐孢子虫和大肠埃希菌基因组DNA,判断该方法的特异性;检测100～108copy/μl重组质粒,判断该方法的敏感性。对采自河北某奶牛养殖场的50份污水样品,分别采用免疫荧光分析法(IFA)和IMS-qPCR检测,并比较分析检测结果。结果磁珠与Cp23单克隆抗体的最佳孵育浓度为20 ng/ml,最佳孵育时间为30 min,最佳捕获时间为30 min,卵囊的回收率>95%。PCR扩增产物长度为272 bp,重组质粒经酶切和测序鉴定正确。荧光探针定量PCR结果显示,重组质粒拷贝数与Ct值之间呈现良好的线性关系,相关系数r2=0.996 1。特异性和敏感性检测结果显示,仅微小隐孢子虫有扩增条带,最低10 copy/μl微小隐孢子虫卵囊18S rDNA重组质粒可被检测到。以IFA检测结果为金标准,50份水样的检测结果显示,IMS-qPCR的特异性为100%(18/18),敏感性为93.8%(30/32)。结论 IMS-qPCR可用于检测水源性微小隐孢子虫卵囊。