高通量飞行时间质谱基因分型方法的研究

为了考察飞行时间质谱基因分型方法(MALDI-TOF)的位点分型成功率和分型结果质量的关系,分析了96个SNPs位点的近10000个基因分型数据(用MALDI-TOF“4重”实验方法检测).结果显示,位点分型成功率和分型结果的质量显著正相关.分型成功率低于82%的SNP位点,其高质量结果占的比例开始逐渐降低.提示82%的分型成功率可以作为衡量分型结果质量的数据点.为了进一步提高通量并降低成本,在MALDI-TOF“4重”实验方法的基础上,发展了两种“准8重”实验方法.用新的实验方法检测了95个样本的32个SNPs位点.结果显示“混合准8重”实验方法与“4重”实验方法相比无显著差异,而“复点准8重”的结果差于“4重”分型方法.

相邻碱基组分与产生SNP的转换或颠换在植物基因组中的研究

碱基替换突变是形成物种多态性和造成生物进化的根本原因之一.近年的研究表明:基因组的碱基组分在不同程度上与碱基替换突变的发生相关.以水稻全基因组3611007个SNPs(包括45462个编码区SNPs和242811个内含子区SNPs)和拟南芥全基因组32019个SNPs为研究对象,研究突变位点周围的碱基A&T(A和T)的使用频率和点突变类型的相关性,结果表明:水稻和拟南芥全基因组上转换和颠换的比值(Ts/Tv)以及紧邻突变位点(上下游各1个碱基)上A&T碱基的个数负相关.统计了6种SNP的AT2(直接相邻的碱基是A或T的个数)和AT0(直接相邻碱基是C或G的个数),发现水稻和拟南芥都是C/G型SNP的AT2/AT0值最大,说明C/G型SNP可能受直接临近区域上A&T碱基的影响最大.在水稻全基因组SNPs中,A&T碱基影响突变的范围局限在突变位点上下游2个碱基内.拟南芥A&T碱基影响其全基因组SNPs的范围不超过上下游4个碱基.

正反向测序信息在全基因组序列拼接及分析中的应用

插入片段双末端正反向测序信息(double-barreleddata,DB信息)已广泛应用于大基因组测序组装项目.根据绘制籼稻全基因组工作框架图的经验,总结了DB信息在序列组装流程中的应用,同时,在原有基础上提出了改进的DB信息使用方法,包括基因组序列拼接、质量检验和重叠群的连接.此外,进一步提出了DB信息在下游数据分析过程中新的应用,包括利用DB信息获得基因组文库中每个克隆所包含的基因组片段的精确信息,以及在此基础上设计低成本全基因组基因芯片的一种基因芯片设计新方法.随着待测序物种的逐年增多,相信正反向测序信息在基因组测序组装工作,以及后续的基因组研究中将发挥越来越重要的作用.

去唾液酸糖蛋白受体H1亚单位基因片段的克隆表达及其检测自身免疫性肝炎的价值

目的 克隆去唾液酸糖蛋白受体（asialoglycoprotein receptor，ASGPR）H1亚单位显性表位435bp基因片段，构建表达重组质粒，进行表达、纯化，以获得具有免疫活性的ASGPR蛋白，建立间接ELISA法，并探讨其在检测自身免疫性肝炎（AIH）中抗ASGPR抗体的价值。方法将ASGPRH1亚单位糖类识别区（CRDH1）435bp的基因片段定向克隆至真核表达载体PEGH，经D-半乳糖诱导表达，表达产物用谷胱甘肽凝胶珠（Glutathione Sepharose4B）亲和纯化，并通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和免疫印迹法（WB）及蛋白质谱（MALDI—TOF）进行免疫活性鉴定，应用表达蛋白建立ELISA法。同时用该方法检测45例AIH、30例SLE、30例类风湿关节炎（RA）、10例原发性干燥综合征（SS）患者、30名健康献血者的抗ASGPR抗体阳性率。结果经重组质粒测序结果证实，CRDH1／PEGH目的基因已正确插入真核表达载体中，基因序列正确，符合表达框架；SDS—PAGE检测表达产物为1条相对分子质量42500的蛋白表达条带。质谱蛋白肽指纹数据通过Mascot在人类蛋白质数据库中分析比对，与ASGPRH1亚单位蛋白同源性为98．34％，WB分析表明，重组蛋白具有人ASGPR抗原反应性；间接ELISA检测血清结果显示，AIH组中抗ASGPR抗体的阳性率为35．6％（16／45），非AIH组均为阴性，差异有统计学意义（X^2=31．85，P〈0．01）。结论成功克隆的ASGPRH1基因可在啤酒酵母菌中成功表达，且重组的自身抗原具有较好的抗原性和特异性。应用纯化蛋白建立的间接ELISA检测AIH抗ASGPR抗体具有较好的特异性。