基于扩散理论的生物组织固有荧光光谱复原方法研究

组织固有荧光光谱定义为未受生物组织吸收、散射作用影响的荧光光谱,能够直接反映组织微观结构和生物化学性质信息。为了减少吸收和散射特性对组织荧光光谱的干扰,从实测的组织荧光光谱中复原更能反映组织荧光特性的组织固有荧光光谱,搭建了基于光纤探头的组织光谱测量系统,实现生物组织相同位置处的荧光光谱和漫反射光谱测量。提出运用扩散理论从实测的漫反射光谱中提取组织生理参数,包括组织中血液体积分数、血氧饱和度、黑色素含量以及波长500nm处约化散射系数和瑞利散射在总散射中的比例,进而计算可见波段范围内的组织光学参数;然后,根据组织光学参数和实测的漫反射光谱,从实测的荧光光谱中复原得到组织固有荧光光谱。进行临床试验验证,采集受试者皮肤组织荧光光谱与组织漫反射光谱,并复原皮肤固有荧光光谱。通过复原得到的固有荧光光谱反映人体皮肤糖基化终产物积聚量,并最终用于糖尿病无创筛查。结果显示,分别使用实测的荧光光谱和复原得到的固有荧光光谱用于糖尿病筛查时,在特异性水平同为75%时,敏感性分别为69%和90%。

高通量微流控荧光定量PCR激发光非均匀性研究

研究高通量微流控荧光定量聚合酶链反应(PCR)激发光非均匀性问题对提高DNA浓度定量结果的精度具有重要意义。根据荧光定量PCR的原理,分析了激发光非均匀性对循环阙值(Ct)测量精度的影响,给出了激发光非均匀性引起Ct值测量偏差的表达式,确定了激发光强度标准偏差应小于11.56%的要求。根据微流控芯片结构特点及激发光均匀性要求,设计了基于光棒的匀光光路用于解决激发光照度非均匀性问题。模拟及实验所得到的激发光照度的相对标准偏差分别为3.10%、6.01.%,二者均小于11.56%。所设计匀光光路能够满足高通量微流控荧光定量PCR的要求.

用于数字等温扩增系统的荧光图像分析技术

基于微流控芯片的数字等温扩增技术作为一种新型分子检测技术,可以通过对采集到的荧光图像进行特定的图像处理,以实现对待测目标的绝对定量分析。本研究利用本课题组研制的数字微流控芯片所采集到的荧光图像为分析对象,并结合实际应用环境,开发出配套的软件分析系统。该系统中的荧光图像处理分析部分具备图像拼接、图像倾斜校正、目标区域的截取、图像分割以及荧光亮点计数等功能。该系统能很好地满足核酸分子数检测的需求,并具有良好的人机交互性能。结果表明该系统的分析结果与Image J图像处理软件的统计结果不仅具有一致性,而且能够对检测到的结果实现自动化的计算分析,这为该款软件分析系统的广泛应用奠定了坚实的基础。

组织固有荧光光谱复原算法及其在糖尿病筛查中的应用研究

通过设计不同光学参数的组织仿体,研究吸收、散射对组织荧光光谱及组织漫反射光谱的影响规律,优化经验复原算法,以校正吸收、散射的影响,获得组织的固有荧光光谱。结果显示:使用优化的经验复原算法(经验参数kx和km分别为0.9和-0.8)能够有效降低吸收、散射对荧光强度的影响,且荧光强度与荧光成分的浓度线性相关。在基于皮肤组织荧光光谱法筛查糖尿病的应用研究中应用上述光谱复原算法,结果显示:与原始荧光光谱相比,采用复原后的固有荧光光谱进行糖尿病筛查时,受试者工作特征(ROC)曲线覆盖面积由0.54增加至0.81,在特异性同为70.6%时,敏感性由38.6%增至77.6%。采用组织仿体优化生物组织固有荧光光谱经验复原算法能有效提高荧光光谱的临床应用价值。

多重巢式固相PCR-Array芯片用于高致病性病原微生物并行检测

提出了一种多重巢式固相PCR的方法,以微流控芯片为载体,采用紫外交联方式将寡核苷酸序列固定在芯片上,构建了阵列式固相PCR-阵列(PCR-Array)芯片,用于细菌和病毒类高致病性病原微生物的并行检测。选择新疆出血热病毒、埃博拉病毒、炭疽杆菌和布鲁氏菌4种代表性高致病性病原微生物为研究对象,通过基因工程手段构建了包含有炭疽杆菌和布鲁氏菌特异性基因片段的重组质粒载体,利用病毒包装技术构建了包含有两种病毒特异性基因片段的逆转录病毒颗粒,完成了4种高致病性病原微生物阳性标准品的制备,并以此作为实验样本,探究了多重巢式固相PCR-Array芯片的制备方法和扩增体系。结果表明,在优化的实验条件下,多重巢式固相PCR-Array芯片检测4种高致病性病原微生物的检出限达10 copy/μL以下量级。本方法灵敏度高,特异性好,同时,引物空间上的隔离避免了相互干扰,提高了检测通量,在多种病原微生物快速并行检测方面具有良好的应用前景。

荧光光谱法无创检测糖基化终产物在体检人群中进行空腹高血糖筛查的应用研究

目的分析荧光光谱法无创检测糖基化终产物（AGE）在体检人群中进行空腹高血糖筛查的应用价值。方法1388例体检受试者，依据空腹血糖（FPG）分为FPG≥7．0mmo帆组（n=85）和FPG〈7．0mmo、L组（n=l303）。采用自主研发的糖尿病无创检测仪（DMScan）检测受试者皮肤组织中的AGE，检测结果以AGE值表示，并获取相关体检指标。对两组受试者的AGE值和相关体检指标进行统计分析。结果FPG≥7．0mmo、L组的AGE值、血压、总胆固醇和三酰甘油均明显高于FPG〈7．0mmoUL组『AGE值：（74．63±6．97）arb．unit比（61．87±10．54）arb．unit；收缩压：（131．82±16．36）mmHg（1mmHg=0．133kPa）比（119．41±16．47）mmHg；舒张压：（84．47±10．03）mmHg比（79．39±10．07）mmHg；总胆固醇：（5．55±1．29）mmol／L比（5．05±1．02）mmol／L；三酰甘油：（1．88±1．51）mmo、L比（1．24±0．76）mmoYLl，组间差异有统计学意义（P〈0．01）。ROC曲线计算AGE值筛查空腹高血糖最佳诊断点所对应的敏感性和特异性分别为81．2％和71．8％，曲线下面积为0．836。Logistic回归分析显示AGE值是空腹高血糖发生的独立危险因素之一。结论荧光光谱法无创检测糖基化终产物在体检人群中进行空腹高血糖筛查具有一定的应用价值。

基于微流控高分辨率熔解曲线的基因分型研究

目的建立一种用于人类乙醇脱氢酶2(acetaldehyde dehydrogenase 2, ALDH2)基因单核苷酸多态性位点准确快速分型的方法。方法将微流控芯片、实时荧光聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)与高分辨率熔解曲线技术相结合。采用聚合物材料制作微流控芯片,在确保熔解过程中温度变化的均一性和精确性的同时,可显著改善热能传输,提高热循环速度,缩短分析时间,从而实现对单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)位点的快速检测与分析。结果在自主研制的微流控高分辨率熔解曲线分析系统上,以标准质粒为实验材料,测试了该系统的最低检测限可达10 copies/μL。同时,成功地实现了人类ALDH2基因三种基因分型(AA/GG/AG)的检测。结论微流控高分辨率熔解曲线分析系统为ALDH2基因分型提供了一种准确快速的检测方法,对指导临床硝酸甘油的个性化用药具有重要意义。

皮肤胆固醇无创光谱检测模拟和在体实验研究

皮肤胆固醇是评估动脉粥样硬化性疾病风险的新型生物标志物。为实现皮肤胆固醇的无创、快速检测，设计了一套基于漫反射光谱技术的检测系统。采用毛地黄皂苷一辣根过氧化物酶共聚物溶液模拟梯度浓度皮肤胆固醇。通过检测该共聚物溶液和受试者在体皮肤胆固醇，验证了系统的可行性。结果表明，在440～550 nm特征波段内，由相对漫反射率引人的参数S值与共聚物溶液浓度呈线性关系（相关系数r=0．992，P〈0．01）；控制年龄、性别等因素后，受试者在体皮肤胆固醇无创检测结果与血液中总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇呈显著正相关，相关系数r分别为0．837（P〈0．01）和0．778（P〈0．01）。漫反射光谱技术为皮肤胆固醇的检测提供了一种无创、便捷的方法。在体皮肤胆固醇的无创检测有助于动脉粥样硬化性疾病的早期发现。

基于微流控芯片的荧光定量PCR法快速检测乙肝病毒核酸

提出了一种基于微流控荧光定量聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction,PCR)的血液病毒快速检测新技术。采用3D打印技术制作了一种集气动阀和"树型"结构为一体的微流控芯片;运用Comsol软件对芯片导热性能进行了仿真;根据血站血液核酸检测工作中乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、人类免缺陷病毒(HIV)三种病毒的筛查流程,结合高温控性能的微流控荧光定量PCR分析系统,在所设计微流控芯片上开展了血液样本中HBV的检测研究。实验结果表明,该芯片具有良好的温度均匀性和导热性,芯片上可实现血液样本中HBV的快速检测,其Ct值在37左右呈弱阳性。该技术与目前血液筛查使用的大型核酸检测系统相比,具有操作过程简单、所占空间小、检测效率高且试剂消耗量少的优点,进一步优化实验条件可实现多病毒核酸的并行检测。

基于3D打印技术的集成核酸提取芯片制备

基于固相萃取原理,设计并制作了一种集成核酸提取功能的微流控芯片,用于人体全血中脱氧核糖核酸(DNA)的提纯。芯片主要包括:混合微通道、裂解腔、DNA提取腔、DNA存储腔。采用3D打印技术制作出芯片模板,通过模板注塑成型、氧等离子体键合等工艺制作出微流控芯片。利用该芯片,可以在20 min内完成血液和试剂的顺序加载、快速混合、血细胞裂解、DNA的提取等操作,且试剂消耗量少。通过对所提DNA链上稳定表达的内参基因甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)进行PCR扩增,并对扩增产物进行熔解曲线分析,以验证所提取DNA的质量。

基于LabVIEW的芯片PCR扩增荧光检测系统

针对传统的传染病病原体检测需要依靠实验室内昂贵的仪器和专业的技术人员,无法实现现场快速检测的问题,设计了一种基于LabVIEW的集芯片聚合酶链式反应(PCR)扩增和荧光检测于一体的低成本便携式装置。该装置硬件由计算机、USB相机、微流控芯片、温控单元、荧光检测单元等组成。实验时,首先使用LabVIEW编写的上位机程序控制温控单元,实现微流控芯片的PCR;然后在每个PCR循环中的延伸阶段利用USB相机采集一幅荧光图像;最后使用IMAQ Vision软件包对采集的荧光图像进行图像处理分析。通过对寨卡病毒的保守区核酸片段的分析,证明该系统能够满足核酸扩增荧光检测的要求,可以在现场实现核酸扩增检测,提高核酸检测的便携性。

用于微流控荧光PCR的高分辨率温度控制系统

微流控荧光PCR,产物在高分辨率熔解(HRM)曲线分析的过程中,随着DNA的解链荧光强度发生突变,而能否检测到该突变点则依赖于温控的精度。提出了多阈值PID算法,设计了一种适用于高分辨率熔解曲线分析的FPGA温度控制系统。根据测得温度值与设定值之间的差异,改变FPGA电路系统输出的脉冲宽度调制(pulse width modulation,PWM)波占空比和算法的调节频率实现对温度的准确控制。经过温度标定后,系统温度控制精度优于0.1℃,分辨率达到±0.01℃。HRM分析实验结果表明,本方法成功地辨别出了DNA序列的单碱基差异,温度控制系统达到了设计的要求。

基于粒子群优化算法的生物组织固有荧光光谱复原方法

为减少吸收和散射对生物组织荧光光谱的干扰,使用蒙特卡罗(MC)方法模拟不同光学参数下的生物组织荧光和漫反射光,提出基于组织漫反射光谱的荧光复原方法。将复原算法中的经验参数编码为解空间中的一个粒子,以组织荧光临床应用效果作为适应值,构建粒子群优化(PSO)算法实现经验参数优化。利用已建立的用于糖尿病无创筛查的组织光谱测量系统,收集327例受试者的皮肤组织荧光光谱和漫反射光谱,使用基于PSO的组织荧光复原算法进行光谱复原。以复原前、后的组织荧光光谱强度作为输入变量进行受试者工作特性(ROC)曲线分析,观察其在糖尿病筛查中的应用价值。结果显示,采用复原前的组织荧光光谱作为输入变量用于糖尿病筛查时,ROC曲线覆盖面积为0.54,最佳诊断点对应的敏感性为32%、特异性为76%;以复原后的组织荧光光谱作为输入变量时,ROC曲线覆盖面积为0.86,最佳诊断点对应的敏感性和特异性分别为72%、86%。上述结果表明,使用基于PSO的组织固有荧光光谱复原算法能有效提高组织荧光光谱的临床应用价值。

微流控聚合物链式反应芯片的多色荧光检测

为了实现微流控芯片上多目标DNA片段的同时检测,建立了基于光棒匀光结构的微流控芯片多色荧光检测系统。根据微流控芯片中的聚合物链式反应(PCR)反应腔的特点,设计了基于超亮白光LED模组、光棒、二向色镜和CCD的正交型荧光检测系统。CCD可一次采集微流控芯片上所有PCR反应腔中的荧光信号,通过滤光片轮组合的变换,可实现多种荧光标记物的同时检测。采用荧光素钠溶液对激发光的均匀性进行了测试,激发产生的荧光图像均匀度达到93.99%,可满足微流控芯片上多反应腔同时检测的需求。同时,以pUC-18人工质粒DNA作为标准品,开展了微流控荧光PCR生物实验,对系统性能进行验证。实验结果表明:微流控PCR反应腔的DNA浓度变化与荧光信号的变化相一致,pUC-1 8样品的检测限达到0.05pg/uL,扩增效率为97.28%,熔解曲线显示无引物二聚体产生,特异性好,达到了商业化仪器的水平。