人表皮生长因子受体2插入突变导致拉帕替尼耐药的机制

目的探讨人表皮生长因子受体2(ERBB2)的p.Pro780_Tyr781 insGSP插入突变对诱导Lapatinib耐药的机制研究.方法采用聚合酶链反应(PCR)、酶切、连接等方法构建对照组pHelper.CopGFP、野生组pHelper.GV358-ERBB2、突变组pHelper.GV492-ERBB2质粒转染293T细胞,收集上清并包装慢病毒,检测滴度为108,在融合率为70%~80%的MCF-7细胞中进行转染,并在1 mg/L的嘌呤霉素中进行药筛构建稳转株,通过免疫荧光及蛋白印迹法(Western blot)检测转染效率,实验分3组:ERBB2-NC、ERBB2-WT和ERBB2-MT组.通过细胞增殖细胞计数试剂盒(CCK-8)法检测拉帕替尼作用48 h后MCF-7细胞的半数最大抑制浓度(IC50),Western blot检测在拉帕替尼作用下,ERBB2相关信号通路蛋白的表达变化,并测定拉帕替尼对细胞周期变化和细胞凋亡反应的影响.两组间样本均数比较采用t检验,多组间样本采用方差分析.结果成功构建载体并且测序正确,野生型ERBB2(ERBB2-WT)及突变型ERBB2(ERBB2-MT)稳转株构建成功.细胞增殖抑制实验结果显示ERBB2-MT组的细胞对拉帕替尼的IC50值为(90.41±7.47)μmol/L,明显高于ERBB2-WT组IC50(43.94±9.84)μmol/L,ERBB2-MT组与其他两组比较,对拉帕替尼产生显著抗性(F=55.530,P<0.01),通过增加/蛋白激酶B(Akt)的磷酸化水平促进细胞的生长,引起了ERBB2-MT组[(326.00±36.16)个]细胞克隆较ERBB2-WT组[(201.00±10.03)个]增多(t=7.478,P<0.05),并通过抑制晚期细胞的凋亡(WT:22.29±1.53,MT:10.89±2.42,t=6.905,P<0.01)和增强细胞增殖能力(WT:18.95±0.73,MT:33.05±2.69,t=8.774,P<0.01)对拉帕替尼产生耐药性.结论结果表明ERBB2-MT的插入突变为促癌性突变,通过激活Akt信号通路磷酸化而对拉帕替尼的治疗产生抗性.