NtSKP1基因的RNAi载体构建及对烟草的转化

根据枯斑三生烟草SKP1基因(NtSKP1)的序列,设计二对分别含有特定酶切位点的特异引物,以重组质粒pMD18-SKP1为模板,分别扩增目的基因的正反向片段(约473 bp)。将反向目的片段插入中间载体pHANNIBAL内含子右侧,正向目的片段插入该载体内含子左侧,再经NotⅠ酶切回收约3 916 bp目的片段,插入到双元载体质粒pART27中,成功构建了含NtSKP1基因片段正反向重复序列的植物表达载体pART27-skp1sa。将pART27-skp1sa质粒导人根癌农杆菌LBA4404中并转化烟草叶片细胞,经选择分化培养,获得转基因烟草。

烟草SKP1基因的原核表达

为获取大量高纯度的枯斑三生烟SKP1蛋白以便研究其功能和性质,以pMD18-SKP1质粒为模板,PCR扩增枯斑三生烟的SKP1基因的cDNA编码区,经酶切后构建表达载体pET23b-SKP1,转入大肠杆菌BL21(DE3)进行诱导表达,并考察不同的IPTG诱导终浓度、表达时间和表达温度对目的蛋白His-SKP1表达量的影响。SDS-PAGE分析结果表明:最佳表达条件为不加诱导剂的情况下,37℃表达8 h。

NtSKP1基因的反义载体构建及转基因烟草的产生

根据枯斑三生烟SKP1基因(NtSKP1)的序列,设计一对分别含有特定酶切位点的特异引物,以重组质粒pMD18-SKP1为模板,扩增目的基因(约473bp)片段。将反向目的片段插入中间载体pHANNIBAL的内含子右侧,再经NotⅠ酶切回收约3443bp的目的片段,插入到双元载体质粒pART27中,成功构建了含NtSKP1基因片段反向序列的植物表达载体pART27-skp1a,其转录产物能减弱目的基因的表达。将pART27-skp1a质粒导人根癌农杆菌LBA4404中并转化烟草叶片细胞,经选择分化培养,获得转基因烟草。

基于公共基因芯片的多农药代谢相关的拟南芥UGT基因挖掘

糖基转移酶1家族,也称尿苷二磷酸糖基转移酶(Uridine diphosphate glycosyltransferase,UGT),是植物解毒系统中最重要的多基因家族之一。该研究基于公共基因芯片数据对拟南芥(Arabidopsis thaliana)的106个UGT基因进行生物信息学分析,期望找到参与广谱农药代谢的UGT靶标。从NCBI数据库收集并重注释关于农药和除草剂安全剂处理的基因芯片数据,差异表达分析和聚类分析表明8个UGT在绝大部分农药处理中均显著转录上调,是重要候选基因。基因本体论(Gene ontology,GO)富集分析表明,候选UGT的共表达基因富集于植物4相代谢解毒过程,暗示这些UGT基因的广谱解毒能力。最后以候选UGT基因及其共表达基因构建共表达网络,发现网络中的桥接节点也参与了植物解毒过程,表明UGT76B4和UGT76B5是最关键的参与多种农药代谢的UGT基因。

猕猴桃LysM型类受体激酶基因家族生物信息学分析

植物Lys M型类受体激酶基因家族(lysin motif receptor-like kinase,LYKs)在植物自身免疫防御系统及与病原微生物协同进化中的重要作用已被证实,目前已成为研究植物基因功能的热点。本研究以生物信息学方法在猕猴桃全基因组范围内鉴定并命名Ac LysM基因家族成员,分析其家族成员染色体定位、蛋白基序、结构域和亚细胞定位,以及AcLysM基因家族成员的蛋白理化性质。共获得40个AcLysM基因家族成员,其蛋白分子量范围为10~126 kD、等电点在4.43~9.42之间,平均亲水系数介于-0.603~0.484。AcLysM基因家族成员分为三个亚类,亲缘关系较近的家族成员往往具有相同的motif和domain,甚至多个基序和结构域的排序都是相似的,推测该亚族成员在猕猴桃进化过程中执行相似的功能,在响应猕猴桃病菌侵染的过程中发挥重要的激发、传导和调控作用。本研究分析了猕猴桃LysM型类受体激酶基因家族,为后续深入研究LysM基因家族成员在猕猴桃抵御病虫害中的作用提供理论依据。