转基因棉花再生植株育性影响因素研究

【目的】探究影响农杆菌介导棉花体细胞转化体系产生的再生植株育性的影响因素。【方法】从载体大小、目的基因大小、不同阶段组织培养时间等因素对6个载体的转基因再生植株当代(T0)育性影响进行分析。【结果】不同载体/目的基因的转基因植株不育率呈现显著差异,但是转基因植株育性与载体大小、目的基因大小之间没有明显关系。进一步研究发现转基因再生植株不育率与胚性愈伤组织分化-植株再生的培养时间呈显著正相关,分化-植株再生培养时间少于110 d、110~130 d、130~150 d、150~170 d、超过170 d的植株不育率分别为19.6%、45.5%、63.8%、72.3%、94.5%;而与诱导愈伤组织形成-胚性愈伤组织分化的持续培养时间没有相关性。【结论】转基因棉花再生植株育性受到胚性愈伤组织持续培养时间的显著影响,缩短胚性愈伤组织到植株再生的培养时间能够提高转基因再生植株的育性。

转双价抗虫基因棉花的主要农艺性状的遗传变异

以11个转外源基因(Cry1Ac+API-B)系为材料,受体亲本陆地棉品种鄂抗9号为对照,研究其在抗棉铃虫性、产量和纤维品质性状上的差异。结果表明:11个转基因系的抗棉铃虫效果明显,达到中抗和高抗水平;转基因系及其受体、转基因系之间在单铃重等10个性状上均存在极显著性差异;和受体亲本相比,各个转基因系变异方向比较一致的性状有:衣指、衣分降低;而株高、单株结铃数、单铃重、子指、皮棉产量、纤维长度、断裂比强度、马克隆值、伸长率等性状的变化方向不定。

棉蚜腺苷三磷酸酶E亚基基因RNAi载体的构建及其抗蚜性分析

【目的】棉蚜(Aphis gossypii)是棉花主要害虫之一,严重危害棉花的生产。利用靶标昆虫重要基因的双链RNA进行干涉从而防治农业害虫是当今发展的1种新技术。通过转基因的方法,在棉花中表达棉蚜靶标基因的双链RNA(Double stranded RNA,dsRNA),特异性地抑制棉蚜内源基因的表达,从而控制蚜虫对棉花的危害。【方法】本研究利用棉蚜腺苷三磷酸酶E亚基(Adenosine triphosphatase subunit E,ATPase E)基因,构建其RNA干扰载体,并通过农杆菌介导转化棉花。PCR技术初步筛查45个独立转化植株,对PCR阳性植株进行DNA印迹(Southern blot)分析,确认外源基因插入的拷贝数。同时利用RT-PCR (Reverse transcription polymerase chain reaction)方法检测dsRNA的表达情况。最后结合网棚和大田抗蚜性鉴定分析转基因株系的抗蚜效果。【结果】从45个转基因再生植株中获得22株阳性转基因株,其中12株为单拷贝插入。根据农艺性状和dsRNA表达量分析结果,筛选出4个转基因株系,分别为CZ1、CZ2、CZ3和CZ4。2年的网棚和大田的蚜虫抗性鉴定结果表明:转基因棉花CZ1、CZ2和CZ3具有较高的抗蚜性,2015年和2016年的蚜害减退率分别达70%和60%以上。【结论】利用RNAi技术将蚜虫腺苷三磷酸酶E亚基基因片段转化棉花,可以提高棉花的抗蚜性,为棉花抗蚜育种提供了新种质和新方法。

棉花miRNA表达量检测方法Stem-loop RT-PCR的建立

为建立一套鉴定棉花miRNA表达丰度的分子技术,优化了Stem-loop RT-PCR方法,并通过分析棉花3个miRNA的表达谱来评价分析该技术体系的特性。首先设计3条引物(茎环特异性反转录引物、正向引物和通用反向引物),通过cDNA和RNA梯度稀释,分析引物的扩增效率和检测灵敏度。结果表明,Stem-loop RT-PCR方法中设计的引物具有较高的扩增效率和检测灵敏度,miR156和miR159扩增效率分别为102.0%和103.6%;并对不同miRNA分析其总RNA检测灵敏度,miR156和miR159的总RNA检测灵敏度差异较大,分别为20 ng和2 pg。同时,应用建立的棉花Stem-loop RT-PCR方法,成功地分析了Gh-miR156、Gh-miR159和Gh-miR5658在根茎叶中的表达量。由此可见,棉花Stem-loop RT-PCR方法具有灵敏度高、特异性强、成本较低和适用于一般实验室等优点,为棉花等植物miRNA相关研究提供了技术保证,加快了miRNA及其调控基因功能的研究步伐。

基于三者互作解析的虫媒植物病害前沿防控技术研发策略

虫媒病害是我国农业高产稳产的重大威胁之一,粮食作物、经济作物以及柑橘等多年生木本作物的病毒病害、细菌病害给我国乃至全球农业生产带来了严重的损失。介体昆虫在虫媒病害的流行和传播过程中发挥着重要作用,而虫媒病原的抗性基因研究在主要作物中匮乏,介体昆虫的抗性基因研究尚属空白,所以目前农业生产高度依赖化学杀虫剂对虫媒病害进行防治,导致昆虫耐药性和环境污染等问题,严重影响了我国和世界人民"舌尖上的安全"和生态文明建设。因此,深入探索病原—昆虫—植物三者互惠共生、协同进化的机制,研究农业生态系统中多病原、微生物组、昆虫群落包括天敌等生态因子和环境因子,明确病害流行、爆发、控制过程中的机制和调控关键节点,设计靶向性强、生态安全的新型调控剂和植物保护方案,均将为虫媒病毒的绿色防控提供新的理论基础。本文提出了病原—昆虫—植物三者互作的理论假说体系,包括了三者互作的核心、内层和外围组成;简要总结了三者互作的主要科学问题和目前研究现状;明确了现阶段主要集中于植物挥发物、植物激素以及外界环境在病原—昆虫—植物三者互作中的作用研究;分析了未来在三者互作研究过程中可能存在的瓶颈问题;力求为虫媒病害的绿色防控提供有力的理论基础和技术支持。