通过N端引入芳香族氨基酸提高木聚糖酶的热稳定性

耐热的木聚糖酶具有用于造纸、麻类脱胶和饲料生产等工业领域的巨大潜力,为了提高11家族碱性木聚糖酶Xyn11A-LC的热稳定性,通过理性设计在N-末端引入了芳香族氨基酸(T9Y和D14F)。测定野生型和突变体的性质表明,突变体的最适反应温度和热稳定性均获得了提高。突变体的最适反应温度比野生型提高了5℃。野生型在65℃的Tris/HCl缓冲液(pH 8.0)中的半衰期为22 min,而突变体在此条件下的半衰期为106 min。圆二色光谱测定结果显示野生型和突变体的Tm分别为55.3℃和67.9℃。因此,通过在N-末端引入芳香族氨基酸可以提高11家族木聚糖酶的热稳定性和在高温下的活性。

α-环糊精糖基转移酶活性区域突变提高选择形成γ-环糊精能力

探讨α-环糊精糖基转移酶（CGT酶）活性区域-3亚位点（47位赖氨酸残基），-7亚位点（146～152位氨基酸残基）以及环化中心位点（195位酪氨酸残基）对其催化底物形成Y一环糊精（CD）能力的影响。将α-CGT酶相应位点分别进行如下突变：K47T，Y195I，以及146～152位氨基酸残基替换为异亮氨酸（命名为△6），并在大肠杆菌BL21中实现异源活性表达。以可溶性淀粉作为底物进行转化，利用HPLC分析各种突变酶的催化产物中3种环糊精产量和比例。结果表明，和野生酶相比，所有突变酶的淀粉水解活性和环糊精总生成量都有不同程度的下降。在产物的组成方面，突变酶Y1951的催化产物中，α-CD的含量由68％降为30％，β—CD由22．2％提高为33．3％；而γ-CD由8．9％提高为36．7％，含量提高了4倍，取代α-CD成为产物中的主要成分；γ-CD的实际产量为1．1g／L，是野生酶（0．4g／L）的3倍。突变酶K47T和△6的转化产物中α-CD比例有不同程度下降，但仍然是产物中的主要组分，β-和γ-CD的比例都有所增加。由此可见，活性区域中195位氨基酸对于α-CGT酶的活力和催化选择性具有重要的影响，Y195I突变体酶最有利于选择性形成γ—CD。纯化后突变酶Y1951的酶学性质试验表明，其最适反应温度和野生酶相同，但最适反应pH有所提高，且比野生酶具有更好的pH稳定性。因此，突变酶Y195I具有生产制备γ-CD的潜力。