钝齿棒杆菌CD945丙酮酸羧化酶基因的克隆、序列分析及表达

以钝齿棒杆菌 (Corynebacteriumcrenatum)突变株CD945的基因组为模板 ,运用PCR方法 ,扩增出丙酮酸羧化酶的基因片段。核苷酸序列分析结果表明 ,该片段全长 365 7bp ,以GTG为起始密码子 ,编码一个ORF。该ORF的核酸序列与Corynebacteriumglutamicum ,Mycobacteri umsmegmatis以及Saccharomycescerevisiae的丙酮酸羧化酶结构基因相比 ,相似性分别为98 2 2 %、62 41 %和 49 61 %。由ORF推导出的氨基酸序列与上述属种的丙酮酸羧化酶相比 ,同源性分别是 99 30 %、64 65 %和 44 0 4 %。经证实对于酶的催化活性至关重要的一些保守区域 ,如ATP和生物素的结合位点等 ,在该氨基酸序列中都存在。将该基因片段转化钝齿棒杆菌 (C .crenatum)CD945 ,利用CTAB处理细胞和苹果酸脱氢酶偶联测定相结合的方法 ,进行酶活力的分析 ,结果表明 ,重组子与供体菌相比 ,丙酮酸羧化酶的活力提高

钝齿棒杆菌天冬氨酸激酶基因的克隆和序列分析

运用PCR方法 ,从野生型钝齿棒杆菌株 (Corynebacteriumcrenatum)AS1 5 4 2及具有AEC抗性的突变株CD945染色体上分别扩增出天冬氨酸激酶 (AK)基因 (ask) ,构建了重组质粒。核苷酸序列分析表明 ,C .crenatumAS1 5 4 2AK基因与C .crenatumCD945相比 ,第 1 1 99位的碱基由T变为C ,引起酶蛋白β亚基第 80位氨基酸从亮氨酸变成脯氨酸。该氨基酸的突变在蛋白结构上位于ACT结构域内 ,该区受赖氨酸调控。C .crenatumAS1 5 4 2的AK基因的编码区核苷酸序列与C .glutamicum、C .flavum及B .lactofermentum相比 ,同源性分别为 97 2 3 %、97 5 5 %和 97 6 2 % ,酶蛋白氨基酸序列的同源性分别为 99 76 %、99 5 2 %和 99 76 %。但在AK基因的启动子上游序列部分与其它棒杆菌相比有较大差异。

抗反馈抑制的天冬氨酸激酶基因在钝齿棒杆菌中的表达

将来自钝齿棒杆菌(Corynebacteriumcrenatum)CD945具有AEC抗性的天冬氨酸激酶(AKfbr)基因克隆到穿梭载体pJC1上,构建重组质粒pLY153。用电击法将质粒pLY153转化到野生型菌株C.crenatumAS1.542及其突变株C.crenatumCD945中。携带AKfbr基因的C.crenatumAS1.542菌株能抗浓度皆为12mgmL的AEC和苏氨酸。AKfbr基因在C.crenatumCD945中得到表达,天冬氨酸激酶活性提高4倍。摇瓶发酵实验结果表明,重组菌在对数前期和中期生长正常,不受抑制;与对照菌相比,赖氨酸终产量提高22%,赖氨酸生产率提高23%。