产海因酶的菌种筛选和产酶条件的研究

利用5-苄海因作为唯一氮源法筛选高产海因酶的菌种。从本实验室保存的221株菌种中筛选出12株具有不对称水解5-苄海因生成N-氨甲酰基-苯丙氨酸的菌株,其中假单胞菌(Pseudomonas sp.)X_4-49具有较高的产酶活力。对此菌的产酶条件的研究表明,产酶的最佳碳源为甘油,最佳氮源为蛋白胨,最佳诱导物为苄海因、尿嘧啶。苄海因作为诱导物的有效浓度为0.2％,产酶的最适培养基的初始pH为7.0,培养条件为33℃,13h。

大肠杆菌CMP-唾液酸合成酶最小活性域的研究

比较大肠杆菌与脑膜炎奈瑟氏球菌的CMP 唾液酸合成酶的氨基酸序列 ,发现大肠杆菌CMP 唾液酸合成酶的保守区域主要位于N 端 ,其C 末端似乎对其催化活性没有作用。通过PCR方法 ,对大肠杆菌CMP 唾液酸合成酶的C 末端进行了一系列截短 ,将得到的产物连接至表达载体pET 15b中 ,在大肠杆菌BL2 1(DE3)pLysS中表达。经IPTG诱导 ,发现从C 末端截去 189个氨基酸酶仍有催化活性 ,说明大肠杆菌CMP 唾液酸合成酶的最小活性域主要集中在N 末端的 2 2 9个氨基酸。有催化活性的C 端缺失突变合成酶的比活、最适pH及热稳定性发生变化 ,提示被截去的C 端氨基酸残基虽不直接参与构成酶的催化活性中心 ,但可影响催化活性域的构象 。