锦鲤疱疹病毒的检测与人工感染试验

基于在美国和以色列普通鲤鱼和锦鲤中分离了一种新的疱疹病毒,命名为锦鲤疱疹病毒(KHV)或鲤鱼肾炎鳃坏死病毒(CNGV).本文根据GenBank登记的KHV序列设计了两对特异性引物,在我国患病的锦鲤样品中检测到该类病毒DNA.经对PCR产物进行克隆测序,结果表明与GenBank登记序列完全一致.用组织匀浆上清人工感染健康锦鲤,并从试验感染鱼组织中检测到KHV病毒DNA.该结果表明KHV或CNGV已经传播到我国,应引起重视.

对虾白斑综合征病毒VP28免疫后克氏原螯虾血清酶活性及中和活性

利用原核表达的对虾白斑综合征病毒(white spot syndrome virus,WSSV)结构蛋白VP28口服免疫克氏原螯虾,以酚氧化酶和溶菌酶指标来监测机体的免疫反应,并检测免疫后的螯虾血清对WSSV的中和能力.结果表明VP28能有效激起机体的免疫反应,酚氧化酶活性始终处于较低的水平,低于GST对照组和健康组,溶菌酶活性则高于GST对照组和健康组.中和实验表明免疫血清具有一定的中和活性,但其保护作用不是通过VP28进入体内与细胞受体结合,来阻止病毒进入,而可能是通过病毒蛋白进入虾体后刺激机体产生或分泌某种中和因子,从而阻止病毒进入细胞或进入细胞后阻止进一步传播.

人FRNK重组腺病毒的构建

目的:应用AdEasy复制缺陷型腺病毒载体系统构建人FRNK基因重组腺病毒,并在HEK293细胞中扩增制备重组病毒。方法:把人FRNK基因克隆入腺病毒穿梭载体pAdTrack-CMV中,构建腺病毒质粒pAdTrack-CMV-hFRNK,经PmeⅠ内切酶酶切成线性化后,采用电穿孔转化将其转化到含有腺病毒骨架载体pAdEasy-1的感受态大肠杆菌BJ5183中,通过卡那霉素筛选获得阳性腺病毒重组质粒。再将获得的腺病毒重组质粒转染到HEK293细胞进行包装,获得人FRNK重组腺病毒pAdhFRNK。荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达。结果:经酶切和绿色荧光蛋白表达证明了hFRNK基因的重组腺病毒载体pAdhFRNK构建成功,并制备出高滴度的重组病毒。结论:成功构建携带人FRNK基因的重组腺病毒pAdhFRNK,为研究FRNK的基因治疗奠定了基础。

B组轮状病毒WH-1株nsp2基因的原核表达与抗体制备

根据B组轮状病毒(GBRV)WH-1株nsp2基因的全序列,设计引物,用PCR的方法扩增得到nsp2基因的编码区.将其片段克隆到原核表达载体pGEX-KG上,经IPTG诱导,在E.coliDH5α菌株中得到高效表达.表达的GST融合蛋白大小为61×103,经SDS-PAGE分离纯化,免疫小白鼠制备了多克隆抗体.抗体经1∶3 000倍稀释后用于Western Blot分析,获得特异性显色信号.所表达的蛋白和制备的抗体可用于蛋白结构和功能的进一步研究.

一株鸭细小病毒的分离鉴定与ns基因序列分析

采用余姚某鸭场濒死鸭肝组织悬液,接种鸭胚尿囊腔增殖病毒,蔗糖梯度离心法纯化病毒,电镜观察见直径约20nm的球形病毒粒子,免疫琼脂扩散实验结果显示与鸭细小病毒(duck parvovirus ,DPV)抗血清有明显沉淀线;SDS-PAGE电泳可见3条结构蛋白带,与DPV毒株一致;参照GenBank DPV-ns基因序列979～1 566 bp设计引物,PCR扩增反应获得其目的片段.克隆到载体pMD18-T后测序,该序列与GenBank 中的番鸭细小病毒(Muscovy duck parvovirus,MDPV)以及巴比里鸭细小病毒(Barbarie duck parvovirus,BDPV)的ns基因序列同源性为98%.病鸭肝组织匀浆液雏鸭感染试验显示雏鸭发病症状及剖解病理变化明显,死亡率为75%.利用血清学实验与鸭肝炎I型、禽流感和新城疫病毒感染鉴别.由此确定引起本次鸭场疫病的病原为DPV,命名为04NY株.

RNA药物抗乙型肝炎病毒的研究进展

乙型肝炎病毒(hepatitis Bvirus,HBV)导致的慢性感染已经成为威胁全球健康的主要问题之一.传统的抗乙肝药物如以拉米夫定和阿德福韦为代表的核苷类似物以及干扰素类药物在临床上都存在一定的局限性,因此寻找新的抗乙肝药物已经成为当务之急.本文主要从小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)、微小RNA(microRNA,miRNA)和配体指数富集的系统进化技术(systematic evolution of ligands by exponential enrichment,SELEX)筛选的RNA适配子这3个方面来分别阐述用小分子RNA药物抗HBV的研究进展和展望.

一株H5N1亚型禽流感毒的分离鉴定与基因组序列分析

对一株于2005年从浙江省分离获得的禽流感病毒株（A／Chicken／zhejiang／24／2005）进行了鉴定、全基因组序列测定、分析和致病性研究．经血凝抑制试验和神经氨酸酶抑制试验证实，此分离病毒株为H5NI亚型．对该毒株的全基因组序列测定和分析显示，HA蛋白在HA1和HA2连接处，含有连续多碱性氨基酸模体（-RRKKR-）．进化分析结果表明，A／Chicken／zhejiang／24／2005（H5N1）7个基因来源于2004～2005年湖南地区流行株，但PB1基因来源于未知野禽毒株．动物实验结果显示，Ck／ZJ／24／05对鸡和鸭均具有高致病性，对小鼠无致病性，与HA的序列特征相符合．

HBx介导的促肝癌作用

乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)感染是诱发原发性肝癌的主要原因之一.HBV存在4个相互重叠的开放读码框:S,C,P和X区.其中X基因表达的蛋白HBx被认为是诱导肝癌发生的一种多功能致癌蛋白,它可以作用于众多信号通路及细胞因子从而诱发肝癌.本文根据最新的研究,选择其中p53和NF-κB两条信号通路及HBx与表观遗传修饰的相关性进行了探讨,目的在于部分揭示HBV感染诱发肝癌的发病机理.

昆虫细胞凋亡蛋白酶caspase-1的表达纯化及活性分析

依赖于天冬氨酸的半胱氨酸蛋白酶(caspase)在细胞凋亡途径中起着不可替代的关键酶作用.本研究采用原核表达载体pET32a表达和纯化了家蚕细胞Bm-caspase-1及粉纹夜蛾细胞Tni-caspase-1蛋白酶,序列分析表明二者具有相同的内部剪切识别序列,且酶活性位点均为QACQ↓G.纯化获得大量可溶性蛋白酶,Western-blotting分析表明Bm-caspase-1在大肠杆菌中已自我剪切活化,而Tni-caspase-1没有自我剪切,无酶活性;活性Bm-caspase-1蛋白酶对caspase-3特异性底物Ac-DEVD-AMC的降解酶活性可被Z-VAD-FMK呈剂量依赖性抑制,半抑制浓度约20nmol/L.此外,活性Bm-caspase-1蛋白酶能够转活化无活性的Tni-caspase-1蛋白酶原.结果揭示了昆虫细胞caspase同样具有与哺乳动物细胞caspase相似的底物降解活性并可相互剪切激活,为进一步研究昆虫细胞凋亡的分子途径奠定了基础.