专家讨论2020年中国的科学和技术发展研究——基因组工程

1972年，斯坦福大学Berg实验室成功地完成世界上第一个体外基因重组实验，启动了重组DNA技术研究发展，直接导致了生命科学研究领域革命性的变化和一种全新的生物技术学科及产业的建立——基因工程。基因工程的诞生使得外源基因在细菌、酵母和动植物体内进行表达，从而打破了物种的遗传界限．在实验室内可以用工程原理和技术对生物直接进行改造。

中国生物技术产业化现状

本文简要评介我国生物技术产业化的现状，包括医药的基因工程药物、基因治疗、基因芯片、发酵制药、动植物制药、农业的转基因植物细胞工程育种、生物农药、生物肥料、轻化工及食品、海洋生物技术、环境生物技术以及产业化转化的生化工程等方面。并指出生物技术的实验室成果转化中，生化研究和中试开发是有待加强的环节，与化学工程的发展密切相关，可供制定规划和确定研究课题参考。

以人为本发展生物技术和生化工程

概述了生物技术和生化工程的发展状况及其产业化的途径 。

更年健上调老年雌性大鼠下丘脑雌激素受体mRNA表达对P物质和β-内啡肽的影响

目的：探讨中药复方更年健上调老年雌性大鼠下丘脑雌激素受体（ ＥＲ）和 ＥＲ信使核糖核酸（ｍＲＮＡ）对Ｐ物质（ＳＰ）和β－内啡肽（β－ＥＰ）的影响。方法：建立自然衰老的雌性大鼠模型，用放射配体结合分析法检测 ＥＲ，用 Ｎｏｒｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ分析 ＥＲｍＲＮＡ的改变，用放射免疫分析法检测 ＳＰ和β－ＥＰ含量。结果：老年雌性大鼠性减退期下丘脑 ＥＲ和 ＥＲｍＲＮＡ水平随血清Ｅ_２水平的下降较性成熟期显著下降，而更年健则使下降了的ＥＲ和ＥＲｍＲＮＡ水平明显提高，并通过上调下丘脑ＥＲｍＲＮＡ使ＳＰ明显下降，而β－ＥＰ则显著提高，与提高体内雌激素水平具有同样的效果。结论：更年健可增加ＲＲ在下丘脑的表达以增强雌激素的生物学效应，同时降低下丘脑 ＳＰ水平而提高 β－ＥＰ的含量。

柴胡皂甙d上调人急性早幼粒白血病细胞糖皮质激素受体mRNA对细胞生长的影响

目的：观察柴胡皂甙d（SSd）对人急性早幼粒白血症细胞（HL60）糖皮质激素受体（GR）mRNA表达的调节作用及对细胞生长的影响。方法：用从柴胡中提取的单体成分SSd，以3H-胸腺嘧啶（3H－TdR）掺入法和流式细胞仪观察细胞生长，用Northernblot分析SSd对GRmRNA的改变。结果：经SSd作用后，HL60细胞2H－TdR掺入率明显降低，呈时间和剂量依赖关系，SSd10μg／ml处理48h作用最明显；流式细胞仅分析细胞呈现G0／G1期阻滞现象，GRmRNA表达增加。结论：SSd可上调HL60细胞GRmRNA表达并抑制细胞生长。

肥大细胞功能对针刺大鼠“足三里”镇痛效应的影响

目的:观察穴位肥大细胞与针刺效应之间的关系。方法:SD大鼠48只,随机分为正常对照组、穴位针刺组、旁开针刺组、色甘酸钠组、生理盐水组、色甘酸钠+针刺组、生理盐水+针刺组和色甘酸钠+对侧针刺组。采用大鼠尾部痛阈作为效应指标,在体观察针刺“足三里”提插捻转30 min过程中大鼠的甩尾潜伏期;并通过穴位组织切片染色,离体对照针刺前后穴位处局部肥大细胞脱颗粒率的变化,以及色甘酸钠注射对其的影响。结果:手针大鼠“足三里”穴具有显著镇痛作用,效果明显优于针刺旁开对照点;而在色甘酸钠屏蔽穴位肥大细胞的脱颗粒功能后,这种镇痛作用被明显地削弱。针刺后穴位处局部肥大细胞脱颗粒率显著提高;而注射色甘酸钠可以明显减少该脱颗粒现象。结论:穴位组织中的肥大细胞在针刺镇痛效应的产生过程中起着重要作用,肥大细胞脱颗粒参与了针刺镇痛效应的产生过程。

反义寡核苷酸抑制肿瘤细胞表达VEGF的研究

研究用反义寡核苷酸（ＯＤＮ）抑制肿瘤细胞ＶＥＧＦ的表达，探讨发展新的抗肿瘤药物的可能性。方法Ｓ１８０细胞培养上清液有促进牛脐血管内皮细胞生长的作用。用ＶＥＧＦ的反义ＯＤＮｓ分别加入Ｓ１８０细胞培养液，检查各上清液刺激内皮细胞生长的受抑情况，即可了解ＯＤＮｓ抑制肿瘤细胞表达ＶＥＧＦ的情况。结果证明ＶＥＧＦ反义ＯＤＮｓ确有抑制ＶＥＧＦ表达的作用。结论反义ＶＥＧＦ的ＯＤＮｓ有望成为新一代的抗肿瘤药物。

米非司酮治疗子宫肌瘤的临床疗效及机理探讨

探讨米非司酮（Ru486）治疗子宫肌瘤的临床疗效和机理。方法：应用国产的Ru48625mg／d，治疗39例子宫肌瘤Ⅰ～Ⅱ疗程，B超定期随访子宫肌瘤及子宫体积，放免法监测血性激素水平，Northernblot法和HAP单点饱和分析法检测瘤心、瘤边缘及正常子宫肌组织中的ERmRNA、PRmRNA表达和ER、PR蛋白含量。结果：Ⅰ疗程肌瘤体积明显缩小53．88％，Ⅱ疗程缩小达61．20％，临床总有效率为84．62％。服药前后血性激素水平处于早期滤泡期水平，Ru486治疗后肌瘤和正常子宫肌组织中的PRmRNA表达及PR蛋白含量均显著降低（P＜0.01）。结论：Ru486有可逆性抑制PR及其基因表达作用，同时抑制性腺轴，使肌瘤明显缩小。此疗法有效，副作用小，可重复使用。

足月儿和早产儿母乳中游离和构成蛋白质的氨基酸含量动态比较

目的了解足月儿和早产儿母乳中游离和构成蛋白质的氨基酸含量的动态变化。方法采用氨基酸自动分析仪对不同泌乳期的足月儿和早产儿母乳中游离和构成蛋白质的氨基酸含量进行测定。结果牛磺酸、谷氨酸／谷氨酰胺是母初乳中最丰富的游离氨基酸，而谷氨酸／谷氨酰胺、亮氨酸和天门冬氨酸是蛋白质中含量最丰富的氨基酸，提示了其对新生儿的最佳供应。早产儿母乳中氨基酸谱变化与足月儿母乳有所不同，但更符合于早产儿的需求。结论从氨基酸变化看，母乳为婴儿最佳匹配的食品，对于早产儿更应强调和鼓励母乳喂养。

五指山近交猪胚胎生殖细胞(EG)嵌合体在我国移植产仔

采集25～28日龄的五指山小型猪(WZSP)胚胎原始生殖嵴细胞(PGCs),用于WZSP生殖细胞(EG)建系培养技术研究.研究发现:以DMEM含15%胎牛血清、0.1 mol/L巯基乙醇等为基础培养液,分别添加生长因子20 ng/mL LIF、40 ng/mL hSCF、20 ng/mL hbFGF,以STO为饲养层,进行EG培养建系,WZSP 3 d可出现克隆,其克隆具有出现早,生长数量多,增殖快,成熟亦早,传代率高的特点.培养7～10 d需传代或冷冻保存.EG类细胞冷冻、解冻后尚可复苏,并传至11代.若基础培养液不添加生长因子,培养6～10 d后亦可出现EG克隆细胞株,但其克隆具有出现晚、数量少、增殖慢等特点.研究中还发现25～26日龄的WZSP胚胎的原始生殖嵴小、不易观察、PGCs分离较困难;27～28日龄的WZSP胚胎的原始生殖嵴体积大、易观察、便于分离并可获得多量的PGCs.同时对PGCs进行了形态学、体外分化、AKP染色鉴定等研究.2002年9-12月,在中国农业科学院畜牧研究所五指山猪保种场先后从22头超排处理的大白猪供体中,于配种后(当天为0 d)5.5～7 d实施手术法获得252枚可用胚.将123枚胚胎显微注射WZSP的EG细胞,每枚注射5～15个细胞,与未注射的103枚混合分别移植给9头受体,平均每头受体移植胚胎25.11±5.11枚、含注射EG细胞胚胎13.67±3.57枚,其中7头分别于移植15～22 d返情,1头妊娠,1头待观察.其中2002年9月17日移植30枚胚胎的133号受体,于2003年元月8日产仔8头,其中6头为白色毛仔猪,2头表现为皮肤色素嵌合.

新生大鼠缺氧缺血性脑损伤药物干预的研究

目的 探讨神经生长因子 (NGF)和丹参对新生大鼠缺氧缺血性脑病 (HIE)的防治作用。方法 选用 7日龄新生大鼠 ,在制成HIE模型前后给予NGF和丹参腹腔注射 ,HIE后分期处死大鼠分别测定谷氨酸 (Glu) ,天门冬氨硫 (Asp) ,一氧化氮合酶 (NOS)和做病理检查。 结果 HIE组 (30min)Glu ,Asp和 (48h)NOS较正常对照组明显升高。Glu :(887.0± 145 .2 ) μg/g ,vs.(776 .5± 10 3.0 ) μg/g ,(P <0 .0 5 ) ;Asp :(2 78.6± 48.2 ) μg/g ,vs.(2 2 4.8± 2 7.0 ) μg/g ,(P <0 .0 1) ;NOS :(3.34 6± 0 .745 )U/ml,vs.(2 .195± 0 .6 15 )U/ml,(P <0 .0 1)。NGF和丹参可以抑制HIE后的Glu ,Asp和NOS升高 ,并可减轻脑组织病理改变。Glu :(6 94.9± 83.9) μg/g ,vs .(887.0± 145 .2 ) μg/g ,(P <0 .0 1) ;Asp :(2 0 6 .1± 2 5 .4) μg/g ,vs.(2 78.6± 48.2 ) μg/g ,(P <0 .0 1) ;NOS :(2 .0 41± 0 .35 7)U/ml,vs.(3.34 6± 0 .745 )U/ml,(P <0 .0 1)。结论 NGF和丹参对HIE有防治作用。

RNA干扰介导的胶质瘤细胞IGF-1R基因下调诱导肿瘤细胞凋亡

目的应用RNA干扰(RNAi)技术介导胶质瘤C6细胞株胰岛素生长因子1受体(IGF1R)基因下调诱导C6细胞凋亡的研究。方法体外化学合成靶向IGF1R基因的小干扰RNA(siRNA),脂质体法将siRNA以不同浓度梯度转染C6细胞,设非特异的siRNA阳性对照组和未转染siRNA的阴性对照组:同时使用绿色荧光素标记的小干扰RNA(FITCsiRNA)转染细胞,荧光显微镜下观察siRNA转染效率;RT-PCR法半定量检测siRNA对IGF1R基因表达的抑制作用;流式细胞术检测siRNA诱导细胞凋亡作用。结果荧光显微镜下荧光素标记的siRNA转染组可见细胞质内清晰的绿色荧光,脂质体OligofectamineTM2000的转染效率接近100%;化学合成的siRNA明显抑制IGF1RmRNA的表达,各特异性siRNA不同浓度转染组IGF1RmRNA表达水平可下调约10%～80%,流式细胞术检测细胞凋亡率转染组为22.47%±3.15%,与阳性对照组2.3%±0.9%和阴性对照组1.14%±0.79%比较有明显提高,而阳性、阴性对照组相比无明显差异。结论化学合成的靶向IGF1R的siRNA可以明显下调IGF1R基因的表达,胶质瘤细胞凋亡率明显上升,为进一步进行胶质瘤的基因治疗研究奠定基础。

“更年健”对老年雌性大鼠中缝背核5-羟色胺的影响

应用免疫组织化学和计算机图像分析技术,观察中药“更年健”对老龄雌性大鼠中缝背核5-HT的影响.结果表明:“更年健”和苯甲酸雌二醇用药后,中缝背核5-羟色胺含量明显增高,与用药前相比.相差显著(P<0.01).提示“更年健”能增强老年雌性大鼠中缝背核5-HT神经元活性.

一种基因工程多价疫苗的抗原载体——人乙型肝炎病毒多聚体颗粒性抗原

本世纪70年代基因工程的出现,给疫苗研制尤其是一些难以在细胞上培养的病毒或培养中很危险的病毒疫苗的研制,提供了一条新的途径。然而,将病原的特定保护性抗原基因单独表达或者与一些单体蛋白载体基因融合表达的所谓基因工程亚单位苗,存在一个明显的缺点,由于其抗原单价和分子可溶性,使其免疫原性较弱,达不到保护性免疫的效果。这是至今难以得到理想的基因工程苗的主要原因。近几年来,国外科学家正在探索新的蛋白载体以克服这个缺点。

生长抑素基因初级克隆质粒(pUC12-SS)的改造与鉴定

生长抑素(somatostatin,ss)基因初级克隆质粒(pUC12-SS)含有限制性内切酶BamHI和HindⅢ的重复位点,用HindⅢ酶切处理和T_4DNA连接酶连接后。获得了它们的单一位点。并对经过修饰后的质粒进行了多个酶位点、SS基因片段回切和DNA序列等全面分析和证实。

大鼠着床前后子宫雌激素受体基因表达的研究

本文对大鼠在正常动情期和早期妊娠阶段（ｄ１～ｄ１０）外周血雌二醇（Ｅ２）水平和子宫中雌二醇受体（ＥＲ）基因的表达（以３Ｈ－Ｅ２配体结合饱和分析测定胞浆受体ＥＲｃ和核受体ＥＲｎ，以Ｎｏｒｔｈｅｒｎ印迹法测定ＥＲｍＲＮＡ）作了全面的分析。观察到：（１）在正常动情期和妊娠早期，子宫ＥＲ基因表达受到Ｅ２的上调作用，而且ＥＲｍＲＮＡ和蛋白水平基本同步，说明这种影响是在基因转录水平；（２）受孕后，ＥＲ基因表达水平随外周血Ｅ２的升高也逐步上升，于ｄ４～ｄ５（着床前夕）达到高峰，ｄ６～ｄ７（着床中）突然下跌至低谷，随后回升；（３）孕后ｄ６～ｄ１０子宫着床部位的ＥＲ表达明显低于非着床部位，同时胚胎也有一定的ＥＲ表达。

人睫状神经营养因子结构和功能的研究

目的：制备高活性的重组人睫状神经营养因子（ｈＣＮＴＦ），并研究其生物学功能。方法：应用大肠杆菌表达ｈＣＮＴＦ，用片段插入和缺失法研究其结构与功能关系；切断大鼠坐骨神经，局部及皮下给予ＣＮＴＦ，应用辣根过氧化物酶逆行追踪技术显示再生轴突通过修复部位的胞体。结果：ｈＣＮＴＦ分子中α－螺旋结构的维持对其生物活性十分重要，Ｃ端松散结构对其生物活性贡献不大，Ｄ螺旋中后段可能与生物活性有密切关系；与对照组相比，ＣＮＴＦ组脊髓标记胞体显著增加。结论：本研究为获得高活性、低副作用的ＣＮＴＦ提供了理论依据；所获ｈＣＮＴＦ能明显促进周围神经运动轴突的再生。

前体药物甲氨喋呤-α-肽对前列腺癌动物模型治疗的研究

目的 :研究前列腺癌的导向酶 前体药物疗法 (ADEPT) ,在体内观察前体药物甲氨喋呤 α 肽对前列腺癌的作用。方法 :用前体药物甲氨喋呤 α 苯丙氨酸 (MTX α Phe )和甲氨喋呤 α 精氨酸 (MTX α Arg)对前列腺癌荷瘤裸鼠模型行肿瘤生长抑制及药物动力学的观察。结果 :经抗人精浆蛋白单克隆抗体导向的羧肽酶 A MTX α Phe动物模型体内试验 ,ADEPT治疗组肿瘤生长明显抑制 ,裸鼠生存时间延长 ,生活质量优于单用MTX组。药物动力学显示 ,抗人精浆蛋白单克隆抗体 羧肽酶A注入72h后 ,给于MTX α Phe治疗效果最佳。结论 :MTX α Phe +CP

氨甲喋呤-α-肽的固相合成

用固相肽合成法合成了氨甲喋呤（ＭＴＸ）与ＭＴＸα苯丙氨酸及精氨酸衍生物，产物不经进一步分离纯化即可达到ＨＰＬＣ单峰，质谱分析其分子量符合理论值。ＭＴＸα苯丙氨酸经羧肽酶Ａ处理后，可完全降解为ＭＴＸ。体外细胞毒性试验，两者活性差异在１００倍以上，提示ＭＴＸα苯丙氨酸是一理想的前体药物。