高压冷冻-冷冻替代技术在神经组织超微结构中的应用

采用高压冷冻-冷冻替代技术对小鼠和线虫这两种模式生物的神经组织进行了样品制备、超薄切片和电镜观察,并在取材方式上进行了摸索,旨在比较化学固定法(CF)、高压冷冻固定法(HPF)和化学-高压冷冻联合固定法(CF+HPF)三种不同方式对神经组织超微结构的影响,促进高压冷冻-冷冻替代技术在神经生物学中的应用。透射电镜观察结果显示:与传统的化学固定相比,高压冷冻固定对神经组织样品具有较好的优势,能够减少化学处理所产生的人工假象;另一方面,对于不同动物的神经组织而言,所适用的固定方式也不相同,鼠脑适用于活检枪(biopsy gun)取样后直接进行HPF固定,所得结构比较完整,神经组织微观结构清晰。而在高压冷冻之前选用CF进行预固定,能加大样品结构保存的完整性,但在膜的细腻程度上不如直接进行高压冷冻制样的结果。线虫样品由于存在较厚的体壁保护,它更适于直接进行HPF处理,从而缩短了固定前的滞留时间,可有效保留腹部神经元超微结构。

不同固定方式对贴壁细胞形态和超微结构的影响

为探索和优化贴壁细胞透射电镜制样方法,本试验以鼠肾细胞系HEK293和小鼠成纤维细胞系3T3的贴壁培养细胞为材料,采用三种不同的固定方法,分别为先固定后刮取细胞、先刮取细胞后固定和胰蛋白酶消化后固定,对细胞进行固定和收集,于光学显微镜下观察细胞形态变化并进行电镜样品的制备,比较不同固定方式下细胞形态和超微结构的差异。结果表明,先固定后刮取法能较好保持贴壁细胞原始形态特征,而先刮取后固定法和胰酶消化法都会明显改变贴壁细胞形态,使悬浮起的细胞呈近似球形。在电镜下,三种方法都可以得到良好的超微结构,先固定后刮取的细胞形态更贴近于生理状态,但是其长条形或梭形的形态特征也给细胞超微结构的观察带来一定困难;先刮取后固定法和胰蛋白酶消化法得到的细胞呈圆球形,观察更为方便,但细胞的形态与贴壁时的生理状态不符。本试验为贴壁细胞电镜制样的基础方法研究,为不同的细胞学实验选择适当的前固定处理方式提供了科学的依据。