面向微生物遗传操作的编辑序列设计工具的研究进展

以同源重组、CRISPR等为代表的遗传操作技术是合成生物学的重要支撑技术。高效准确的遗传操作依赖于可准确定位编辑位点和实现序列改造的编辑序列(如引物序列、同源臂序列、sgRNA序列等)。由于遗传改造目标与遗传操作技术丰富多变,加之近年来基于生物铸造厂(BioFoundry)的自动化遗传改造模式对高通量设计的需求日益增加,使得通过计算机辅助设计工具实现精准快速的编辑序列设计愈发重要。本文针对不同阶段实现不同目标的微生物遗传操作技术和相应的编辑序列辅助设计工具的发展进行了综述。按照不同编辑序列类型和遗传操作应用场景,将编辑序列设计工具划分为四种类型:引物设计工具、DNA组装的设计工具、sgRNA设计工具、基因组编辑的全流程设计工具,对各类编辑序列设计工具的应用及存在的问题进行了分析总结并对未来的研究方向进行了展望。编辑序列设计工具的发展将有助于实现合成生物学“设计—构建—测试—学习”(designbuild-test-learn,DBTL)工作循环中上游的基因型“设计”与下游“构建”两个关键环节之间的无缝衔接。

代谢工程改造微生物生产芳香族化合物的研究进展

芳香族化合物广泛应用于化学工业。利用代谢工程改造微生物生产各种芳香族化合物越来越受到人们的关注。通过理性改造,微生物可以定向地大量积累人们需要的各种芳香族化合物。此外,通过设计新的反应途径并引入外源基因,可以拓宽微生物生物合成的产物谱,获得某些具有重要应用价值的新的芳香族化合物。这些研究成果对解决化石能源危机和环境可持续发展问题具有积极意义。本文中,笔者主要对近年来微生物生产各种芳香族化合物的最新研究进展及相应的代谢工程改造策略进行综述,为开展相关研究提供参考。

合成生物制造进展

合成生物制造是以合成生物为工具进行物质加工与合成的生产方式,有望彻底变革未来医药、化工、食品、能源、材料、农业等传统模式,触发新的产业变革,引领新的产业模式和经济形态,重塑碳基物质文明。合成生物制造具有清洁、高效、可再生等特点,能够减少工业经济对生态环境的影响。本文综述了近年来合成生物制造在大宗发酵产品、精细与医药化学品、可再生化学品与聚合材料、天然产物、未来农产品以及一碳原料利用方面的重要进展,对各领域代表性重大产品的技术进展及产业应用状况与潜力进行了探讨。未来,随着合成生物学发展,以及与人工智能、大数据等新技术的融合,通过合成生物制造可以获得更多的生物基产品,促进生物经济形成,更好地服务于人类社会的可持续发展。

5-氨基乙酰丙酸生物合成技术的发展及展望

5-氨基乙酰丙酸(5-ALA)是生物体内天然存在的一种功能性非蛋白质氨基酸,在医药保健和农牧领域具有重要的应用价值。尽管化学合成技术率先打通了5-ALA的制备路线,但工艺的复杂性和高成本问题,限制了其生产规模和应用推广。随着生物技术的兴起,生物合成作为一种绿色替代技术成为解决上述问题的突破口。本文回顾了近50年来5-ALA生物合成技术的发展历程,综述了5-ALA生物合成的3种主要策略,即天然菌株诱变筛选、利用重组外源C4途径的工程菌株催化合成以及基于代谢工程的高效细胞工厂构建,总结了每种策略的技术特点和主要问题,重点介绍了代谢工程改造策略和合成生物技术在5-ALA微生物细胞工厂开发中的应用和研究进展。在此基础上,本文进一步分析了限制5-ALA生物合成的瓶颈,阐述了血红素合成代谢的复杂调控作用和多底物的协同供给在5-ALA生物合成中的重要作用,并从新靶点、新底盘和新技术策略的角度,对合成生物学时代5-ALA生物合成技术未来的发展进行了展望。

枯草芽胞杆菌蛋白质表达分泌系统发展及展望

枯草芽胞杆菌作为革兰阳性模式菌株是基础研究和工业应用的常用宿主细胞。介绍了枯草芽胞杆菌中蛋白合成和分泌过程中的重要步骤及重要调控位点。在枯草芽胞杆菌蛋白表达及分泌系统中,可以针对目标基因在体内的转录、翻译、折叠、转运和菌株改造等方面对表达分泌系统进行优化改良,针对不同的目标蛋白,可进行不同优化模块的组装和拼搭,以达到针对目标蛋白产物定制化地提高产量和分泌量的目的。在未来,随着基因编辑和合成生物技术的发展,菌株改良策略的不断优化,枯草芽胞杆菌将会在工业生产蛋白质制品领域发挥更大的应用价值。

营养因子强化麦角硫因生物合成的研究

以糙皮侧耳CGMCC 6232菌丝体深层发酵制备麦角硫因,通过向发酵培养基中添加不同种类及浓度的无机盐、维生素、生长调节剂、有机酸、氨基酸等营养因子,考察对麦角硫因合成积累的影响,研究可能的前体氨基酸对麦角硫因生物合成的影响规律。结果表明:添加氯化铵、硝酸铵、叶酸、VB1、吲哚丁酸、丙酮酸、柠檬酸、谷氨酸、蛋氨酸、半胱氨酸、组氨酸和甜菜碱对麦角硫因的合成有一定的促进作用,其中以发酵第4天向发酵液中添加15 mmol/L蛋氨酸最利于麦角硫因的合成,发酵液中麦角硫因的含量达192.4 mg/L,比对照组(102 mg/L)提高了88.6%。

天然类胡萝卜素的生物合成研究进展

类胡萝卜素是广泛存在于高等植物、微生物和藻类中的一大类天然色素物质的总称,是重要的天然食用色素群之一。细胞工厂被广泛用于各种化学品、食品和药品等的生产,是绿色生物制造的中心环节。利用细胞工厂合成来源稀缺、获取难度大的高附加值天然类胡萝卜素,具有经济可行和环境友好等优势。类胡萝卜素在抗氧化、视力保护和抗癌等方面具有非常重要的作用。本文对生物合成类胡萝卜素细胞工厂构建过程中的类胡萝卜素基本合成路径解析、底盘细胞的选择和改造、途径的模块组装与适配及合成生物学策略等展开详细介绍。同时,对未来类胡萝卜素生物合成所面临的机遇和挑战进行了展望。

利用定向进化提高基因工程大肠杆菌的甲醇利用能力

甲醇是一种重要的有机化工原料,价格低廉,碳还原度高,在生物化工中是糖质原料的理想替代原料。但是常用的工业微生物宿主如大肠杆菌不能利用甲醇作为碳源,这限制了甲醇在生物化工领域的应用。通过表达甲醇脱氢酶、3-己酮糖-6-磷酸合成酶和6-磷酸-3-己酮糖异构酶在大肠杆菌中构建可同化甲醇的核酮糖单磷酸途径。以基因工程菌作为出发菌株,通过连续传代和定向进化引入随机突变,突变株进行以甲醇为碳源的压力筛选,得到了2株可以利用甲醇生长的突变株。在以甲醇为辅助碳源的培养基中,25113Δfrm A/p ZWM1-13号突变株较原始菌株25113Δfrm A/p ZWM1菌体生长量增加27.6%。对25113Δfrm A/p ZWM1-13号突变株进行^(13)C示踪分析检测蛋白质合成氨基酸,结果表明氨基酸中^(13)C比例有明显提高。其中,甲硫氨酸^(13)C标记含量增加7.236%。因此,定向进化有效地提高了基因工程大肠杆菌的甲醇利用效率。

芳香族化合物微生物代谢工程研究进展

代谢工程从20世纪90年代初期发展至今已有近30年历史,对微生物菌种改良和选育工作起到了极大的推动作用。芳香族化合物是一类可以通过微生物发酵生产的化学品,广泛应用于医药、食品、饲料和材料等领域。利用代谢工程手段对莽草酸和芳香族氨基酸合成途径进行理性改造,微生物细胞可以定向地大量积累人们需要的各种芳香族化合物。笔者对近30年来国内外代谢工程改造微生物合成各种芳香族化合物的研究策略和生物合成途径进行了梳理和总结,以期为开展相关研究提供参考。

D-生物素合成研究进展

D-生物素属于B族维生素,也是合成维生素C的必要物质,最初在酵母的研究过程中被发现,之后与其相关的报道层出不穷。在工业中,D-生物素以化学法合成,但化学法有工艺繁杂以及会对环境造成危害等弊端,而利用生物法合成D-生物素则有工艺简单和环境友好等优点,因此近些年通过微生物合成D-生物素的研究越来越广泛。该文综述了D-生物素的生理作用、化学合成法、生物合成法以及微生物合成D-生物素的研究进展,旨在为以后研究者们对微生物合成D-生物素的研究提供参考。

优化大肠杆菌CRISPR/Cas9基因编辑系统及应用

CRISPR/Cas9基因编辑系统目前已经广泛地应用于大肠杆菌工程菌株的构建,若能构建出一种能连续进行基因编辑的CRISPR/Cas9系统,将极大地提高大肠杆菌工程菌株构建的效率。设计并构建了具有自剪切功能的供体质粒pV4,优化了双质粒CRISPR/Cas9基因编辑系统,实现了基因的连续敲除或整合。pV4质粒,在原始供体质粒placZ的骨架区域添加3个元件:针对供体质粒上氯霉素基因cat的N20-gRNA序列;Ptrc启动子,用于表达cat-N20-gRNA;lacI^q序列,用于表达LacI蛋白调控Ptrc启动子。pV4供体系列质粒(敲除或整合)实现基因编辑后,cat-N20-gRNA在IPTG的诱导表达引导Cas9蛋白对供体质粒进行自剪切,从而方便下一轮基因的编辑。将pV4系列质粒(敲除或整合)应用于产衣康酸工程菌株的构建,连续敲除ptsI、iclR及整合cad基因,基因编辑结果显示,优化后的双质粒CRISPR/Cas9基因编辑系统,能快速消除供体质粒,实现基因的连续敲除或整合,节约了基因操作的时间,有广泛的工程菌株构建应用前景。

植物天然产物微生物重组合成研究进展

植物天然产物是小分子药物、营养品、化妆品、香精香料等的主要来源之一,在国民经济中发挥重要的作用。目前植物天然产物主要依赖于植物提取,这种生产方式占用耕地、生长周期长,而且植物活性成分往往含量低、生产成本高。通过解析植物天然产物生物合成途径,在微生物细胞中重构,创建细胞工厂,实现利用可再生原料发酵合成,为植物天然产物的供给提供了新的路线。本文重点介绍了中国科学院天津工业生物技术研究所在萜类、黄酮类、苯丙素类等重要类型植物天然产物微生物重组合成方面的研究进展,简要探讨了当前研究面临的挑战及未来前景。

工业微生物遗传和环境扰动的调控和适应进化

开发工业微生物,使其利用可再生的原料生产生物燃料、大宗化学品、食品添加剂和营养品、药物以及工业酶等,是发展生物产业的基础。工业微生物高产和胁迫抗性等鲁棒性状受复杂遗传调控网络控制,其改造需要从全基因组尺度进行系统的全局的多位点的扰动,以达到快速积累多样性基因型突变并产生所期望的表型。文中对工业微生物鲁棒性状的遗传调控与胁迫响应机制、基因组全局扰动与多位点快速进化以及细胞水平氧还平衡的全局扰动进行了简要综述,未来需要继续借助系统生物学和合成生物学手段,进一步加强对工业环境下工业微生物鲁棒性状调控机理的解析与建模预测以及系统的工程改造。

黑曲霉柠檬酸工业菌株原生质体制备与转化

黑曲霉是柠檬酸工业化生产的主要发酵菌株。尽管现代遗传操作技术在黑曲霉的实验室菌株、蛋白质生产菌株等的应用中获得了成功,但是柠檬酸工业菌株遗传转化异常困难,成为柠檬酸工业持续升级的重要限制因素。以柠檬酸工业生产实际应用的黑曲霉菌株为研究对象,对其原生质体的制备与再生以及PEG介导的转化等条件进行了细致优化。结果表明,柠檬酸高产工业菌株原生质体的制备需选取丰富培养基中培养48 h的年轻菌丝体,在1.5%裂解酶-0.5%蜗牛酶-0.2%溶菌酶的复合酶解体系下裂解2.5 h,原生质体的制备浓度可达106个/m L以上,原生质体再生效率可达90%以上。原生质体的浓度是原生质体-PEG介导转化方法的关键,当原生质体浓度达到106个/m L以上时,高产柠檬酸菌株的转化效率大幅提高。成功建立了由原生质体-PEG所介导的高产柠檬酸黑曲霉菌株的遗传转化体系。

面向工业生物技术的系统生物学

工业生物技术是以微生物细胞工厂利用可再生的生物原料来生产能源、材料与化学品等的生物技术,在解决资源、能源与环境等问题方面起着越来越重要的作用。系统生物学是全面解析微生物细胞工厂及其发酵过程从“黑箱”到“白箱”的重要研究方法。系统生物学借助基因组、转录组、蛋白质组、代谢组以及代谢流组等多组学数据,可解析微生物细胞工厂在RNA、蛋白与代谢物等不同水平上的变化规律与调控机制。目前,系统生物学在微生物细胞工厂的设计创建与发酵工艺优化中起着越来越重要的指导作用,许多成功应用实例不断涌现,推动着工业生物技术的快速发展。文中重点综述基因组、转录组、蛋白质组、代谢组与代谢流组以及基因组规模的网络模型等各组学技术的最新发展及其在工业生物技术尤其是菌株改造与发酵优化中的应用,并就工业生物技术中系统生物学的未来发展方向进行展望。

CRISPR-Cas9介导的基因组编辑技术的研究进展

CRISPR-Cas(clustered regularly interspaced short palindromic repeats-CRISPR-associated proteins)系统为细菌与古生菌中抵御外源病毒或质粒DNA入侵的获得性免疫系统。该系统在crRNA的指导下,使核酸酶Cas识别并降解外源DNA。其中,Ⅱ型CRISPR-Cas系统最为简单,仅包括一个核酸酶Cas9与tracrRNA:crRNA二聚体便可完成其生物功能。基于CRISPR-Cas9的基因组编辑技术的核心为将tracrRNA:crRNA设计为引导RNA,在引导RNA的指导下Cas9定位于特定DNA序列上,进行DNA双链切割,实现基因组的定向编辑。CRISPR-Cas9系统以设计操纵简便、编辑高效与通用性广等优势成为新一代基因组编辑技术,为基因组定向改造调控与应用等带来突破性革命。从CRISPR-Cas9介导的基因组编辑技术的发展与应用等方面综述其最新研究进展,并着重介绍该技术的关键影响因素,为相关研究者提供参考。

麦角硫因的合成与降解代谢

麦角硫因是一种稀有的天然手性氨基酸类强抗氧化剂,尽管只在部分蕈菌、链霉菌、分枝杆菌等微生物中合成,但可被植物和动物吸收与积累,广泛分布于哺乳动物的细胞和组织中。麦角硫因具有独特的生物学功能和药理活性,是一种在医药、食品、保健品和化妆品等行业极具应用前景的细胞生理保护剂。本文综述了麦角硫因的生物合成与降解代谢,以期利用代谢调控提高麦角硫因的生物合成水平,深入挖掘麦角硫因的生理功能及应用。

全细胞网络重建与细胞工厂设计

在各种组学及其相应的网络研究相对成熟的基础上,集成各组学网络的细胞整合型网络或全细胞网络将大大提高对生物表型的预测能力,并成为代谢工程决策的有力武器.本文在阐述了细胞工厂设计中应该考虑细胞整合网络之后,综述了细胞整合网络的重建、分析、设计方法方面的有关问题,并进一步就研究细胞整合网络涉及的数据库、软件平台、并行计算几方面的作用作了介绍.

左旋多巴的合成研究新进展

左旋多巴(L-DOPA)是治疗帕金森病的最有效药物,在各国的临床中应用广泛。左旋多巴的制备方法包括化学合成、植物提取、酶催化以及微生物合成。化学合成法存在低转化率和环境污染问题。植物提取法不仅产量低,还受到资源限制。酶催化法使用包括酪氨酸酚解酶、酪氨酸酶及羟基苯乙酸3-羟化酶等催化苯类前体合成左旋多巴。随着合成生物学的发展,构建代谢工程微生物、发酵法生产左旋多巴是一种高效、环境友好的新方法,具有良好的应用前景。

产O-乙酰高丝氨酸的大肠杆菌构建与发酵测试

O-乙酰高丝氨酸(OAH)是具有潜在工业应用价值的前体化合物,可用于制备高丝氨酸与蛋氨酸等。以一株改造自苏氨酸产生菌的Escherichia coli Thr L为出发菌株,过表达OAH合成途径中的关键酶高丝氨酸脱氢酶基因thr A和高丝氨酸乙酰基转移酶基因met X,并利用不同强度的启动子组合优化这两个基因的表达水平,通过发酵培养基中的苏氨酸和酵母粉的浓度优化以提升OAH的产生菌株的生产性能。通过启动子组合优化结果发现,当thr A与met X均采用J23110启动子时,该重组菌株E.coliOAH4的OAH合成能力最强,摇瓶发酵50 h后,其OAH产量为1.54 g/L。当苏氨酸的浓度为2 g/L,酵母粉的浓度为6 g/L时,E.coli OAH4的发酵水平最高,摇瓶发酵50 h后,OAH的产量可进一步提升至1.98 g/L。本研究首次在E.coli中实现了OAH的合成,并通过发酵优化确定了OAH的最优发酵条件,为后续OAH生产应用研究奠定了基础。