红细胞裂解法分离及培养大鼠骨髓间充质干细胞(英文)

背景:骨髓间充质干细胞在骨髓中的含量非常少,而且与其他细胞特别是易与红细胞相混杂,因此在分离过程中需去除干扰,以获得尽可能多的高纯度的骨髓间充质干细胞。目的:采用红细胞裂解法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞,同时进行生物学鉴定。设计:观察对比实验。单位:中国航天员科研训练中心航天细胞分子生物学实验室。材料:选用50只生后30d的雄性SD大鼠,体质量100g,SPF级,购自北京实验动物中心(合格证:SCXK(京)2002-0003)。DAB浓缩显色液(含过氧化氢,中杉公司),兔抗大鼠多克隆抗体(武汉博士德公司),FCS(PAA,Austria),LG-DMEM培养基(Sigma,USA)。方法:实验于2004-09/2005-09在中国航天员科研训练中心航天细胞分子生物学实验室完成。将大鼠脱臼处死,暴露骨髓腔,收集细胞悬液,采用全骨髓培养法对骨髓间充质干细胞分离与原代培养。①红细胞裂解实验:取A、B、C、D4管分别加入0.5mL过滤并充分吹打均匀后的骨髓冲洗液,分别对应加入红细胞裂解液、氯化氨2mL、磷酸盐缓冲生理盐水2mL和体积分数为0.04的乙酸溶液0.5mL,分别测量各组吸光度值及血红蛋白浓度,并观察细胞生长情况。②骨髓间充质干细胞生长曲线、倍增时间及表面标志分子表达情况的观察:根据公式:群体倍增时间(TD)=t[lg2/(lgNt-lgN0)](N0和Nt分别代表接种后和培养t小时的细胞数),计算出细胞的群体倍增时间并描绘并分析骨髓间充质干细胞第2、4、6代细胞的生长曲线;采用亚甲基兰染色测定骨髓间充质干细胞增殖情况;采用免疫细胞化学染色检测骨髓间充质干细胞表面标志分子表达情况。主要观察指标:①大鼠骨髓间充质干细胞分离和培养的观察结果。②不同处理方法对红细胞的裂解效果及其对骨髓间充质干细胞生长的影响。③第2、4、6代细胞的生长曲线及细胞倍增时间。④大鼠骨髓间充质干细胞表面标志分子表达情况。结果:①大鼠骨髓间充质干细胞的分离和培养结果:原代培养48h后大部分细胞已贴壁,72h时贴壁细胞已开始分裂增殖。7￣8d后可见有明显集落形成,之后集落迅速增多,不断扩大,互相融合,14～16d时细胞克隆生长稠密。刚传代的细胞呈球形,很快沉降贴壁,少部分圆形细胞悬浮。贴壁细胞均匀分布,3～5d增殖迅速。虽然传代后细胞形态未变,但增殖速度明显增快,约6d长满培养瓶底。②不同处理方法对红细胞的裂解效果及其对骨髓间充质干细胞生长的影响:红细胞裂解液处理组,氯化氨处理组和4%乙酸处理组的血红蛋白浓度明显高于磷酸盐缓冲生理盐水处理组,差异有显著性(P<0.01)。③不同代骨髓间充质干细胞的生长曲线观察结果:第2,4,6代细胞生长曲线基本相同,经过一两天的潜伏适应期后进入对数生长期,第5天达顶点,以后进入平台期(在第5～7天)。第6代骨髓间充质干细胞的潜伏期表现不明显骨髓间充质干细胞的群体倍增时间平均约为34h。④不同代骨髓间充质干细胞的免疫表型鉴定:各代细胞CD44和CD106染色均呈阳性,表现为棕黄色颗粒沉淀,CD34染色呈阴性。结论:采用红细胞裂解液处理骨髓冲洗液后再行接种,能提高骨髓间充质干细胞的贴壁效率,同时不影响其贴壁后的生长,是一种可行的分离方法。细胞表面标记染色鉴定证明,本实验所分离细胞是骨髓间充质干细胞。

骨髓间质干细胞修复受损心肌研究进展

骨髓间充质干细胞是一种多潜能干细胞。在体外培养时,多种诱导因素可使其分化为心肌细胞等。目前进行的动物实验和临床研究表明骨髓间充质干细胞具有促进血管增生以及改善心肌梗死后心脏功能的作用,为受损心肌的治疗提供了广阔前景。但是其修复受损心肌的机制仍具有很大争议。就以上内容进行综述。

体外诱导骨髓间质干细胞向心肌细胞的分化

目的研究在体外5-氮胞苷诱导骨髓间质干细胞定向心肌向分化的条件。方法取成年SD大鼠胫骨/股骨骨髓,分离并培养骨髓间质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)。原代第3天用不同浓度5-氮胞苷作用不同时间。用免疫组化方法鉴定心肌肌钙蛋白(TnT)的表达,并通过RT-PCR鉴定GATA-4和β-MHC的表达。结果诱导后BMSCs细胞增生趋于停滞,10d可见细胞变成长梭状,20d细胞排列出现方向性,有TnT阳性细胞出现,并表达GATA-4和β-MHC。随着诱导药物5-氮胞苷浓度的增加,免疫细胞化学染色TnT阳性细胞增多,且表达更多的GATA-4和β-MHC,至5×10-5mol/L时基本达到峰值。5-氮胞苷对BMSCs的持续性诱导并不能明显增加免疫细胞化学染色TnT阳性细胞数量和GATA-4、β-MHC的表达。结论5-氮胞苷诱导后BMSCs可向心肌细胞分化,是临床心肌细胞成形术理想的供体细胞。

影响骨髓间质干细胞向成骨细胞分化的调控因素

骨骼废用引起的骨质减少主要归因于骨形成的减少,成骨细胞由具有多向分化潜能的间充质细胞经骨原细胞、前成骨细胞分化而来,骨髓间质干细胞是骨髓来源的具有多向分化潜能的干细胞。综述了骨髓间质干细胞向成骨细胞分化的调控因素,有助于增加对骨丢失的理解,并进行预防和治疗,为航天员和骨骼废用病人创造更健康的生活。

骨髓来源成体干细胞在体内外向心肌细胞分化的特性

目的:概述骨髓来源的成体干细胞在体内外心肌向分化的研究进展。资料来源:应用计算机检索Medline1980-01/2005-10相关骨髓来源的干细胞心肌向分化方面的文献,检索词“bonemarrow,stemcells,cardiomyocyte,differentiation”,并限定文献语言种类为English。资料选择:对资料进行初审,选取包括骨髓来源的干细胞心肌向分化的文献,开始查找全文。纳入标准:①骨髓来源的干细胞在体内外分化为心肌细胞的潜能。②骨髓来源的干细胞心肌向分化的影响因素、可能机制和临床实验进展。排除标准:重复研究和综述类文献。资料提炼:共纳入20篇符合标准的关于骨髓来源的干细胞心肌向分化的文献。资料综合:骨髓来源的成体干细胞在体内外分化为心肌细胞的潜能及其影响因素、改善心脏功能的可能机制、临床实验进展以及种子细胞筛选等为当前热点问题。目前主要采用5-氮胞苷、共培养技术和含有胰岛素、地塞米松和抗坏血酸的条件诱导培养基诱导骨髓间质干细胞心肌向分化。骨髓干细胞向心肌细胞分化调节包括基因和环境两大调控因素。新近空间生命科学研究结果发现,力学因素也影响骨髓干细胞心肌向分化。结论:骨髓间质干细胞在体内外都显示出向心肌细胞分化的特性,并能改善心脏功能,具有治疗心肌疾病的更大潜力。

柔嫩艾美耳球虫山西株早熟系的免疫特性

对鸡柔嫩艾美耳球虫山西株早熟系的免疫特性进行了研究。结果表明:该株的早熟系与亲本株具有相同的免疫原性,但致病性大大降低;其最佳免疫剂量和次数:首次免疫为1500个/只,14 d后以2000个/只二免,二免后免疫保护期可达90 d以上,免疫后鸡群的抗球虫能力与血清中特异性IgG的变化规律一致;提示该早熟系具备早熟疫苗株的免疫特性。

柔嫩艾美耳球虫山西分离株的分离与致病性观察

运用单卵囊分离技术，从山西省某鸡场鸡球虫感染粪便样品中获得l株纯种球虫，鉴定为柔嫩艾美耳球虫并命名为Eimeria tenella SX010323，并对其致病性进行了研究。（1）该球虫卵囊寄生于盲肠、为宽卵圆形，卵囊壁光滑、褐色，无卵膜孔，有极粒，无内、外残体。孢子囊呈长卵圆形，有斯氏体。卵囊大小范围为（16．80～28．80）μm×（14．40～25．20）μm，平均大小为（21．54±0．24）μm×（17．85±0．24）μm，形状指数为1．21±0．05。子孢子，大小范围为（10．20～12．75）μm×（4．40—7．25）μm，平均大小为（11．54±0．24）μm×（6．27±0．43）μm。潜隐期为141h，最短孢子化时间为19h；（2）63只11日龄的海兰白公雏随机分为7组，分别口服感染此新鲜卵囊1×10^3、5×10^3、1×10^4、2×10^4、5×10^4、1．0×10^5个，并设立不感染对照组。结果表明：所有感染组增重均低于对照组（P〈O．05），各感染组间随着感染剂量的增加，增重和增重率显著降低，血便率和盲肠病变记分增加（P〈0．05）；（3）将4℃分别保存17、13、10、4、1个月和新鲜孢子化的虫株卵囊，以1．5×10^4个／只的剂量感染11日龄雏鸡，每组10只。结果表明：保存1个月和4个月活力较高，保存10个月活力开始下降，保存13、17个月活力下降较大。

柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)早熟株与亲本株致病性和繁殖力的研究

通过对经15代选育的柔嫩艾美耳球虫(E. tenella)山西株的早熟株与其亲本株的繁殖力和致病性进行比较研究,证实早熟株的潜隐期比亲本株缩短21 h,繁殖力下降40%左右;对致病性的研究显示,早熟株感染后对鸡只增重、AC I的影响较小,对11日龄雏鸡的半数感染量和半数致死量较亲本株增大,肠道病变记分较亲本株下降。由此认为,该早熟株符合球虫早熟株的特性,可用于鸡球虫病早熟苗的制作。

SPR细胞传感器对PMA诱导的C6活细胞内分子事件的动态无创性监测

从分子和细胞水平探讨机体对外界刺激的反应机理,对从微观水平研究活细胞内分子活动的过程、规律及特点以及开展细胞分子生物学研究具有重要意义.本研究针对动态监测和研究活细胞内分子事件的需求,以表面等离子体共振(surfaceplasmonresonance,SPR)技术为核心,设计研制了能够用于细胞培养和动态细胞学效应监测的SPR细胞传感器装置.利用该装置,实时研究了佛波酯作用于C6细胞所诱发的特征性SPR信号.该信号同PMA作用于无细胞的空白传感器明显不同,呈现规律性变化,具有PMA剂量依赖性和饱和性特点,且能够被PKC抑制剂减弱甚至完全抑制.这说明该信号源于PKC活化等细胞内反应所导致的生物分子在细胞膜部位的重新分布.SPR细胞传感器技术为动态、无创性研究活细胞内分子事件发生的时空特点及规律提供了新的量化分析方法与思路.该技术还可用于空间细胞学效应研究、配体垂钓、药物筛选及生物战剂监测等基础研究和应用研究.

60d头低位卧床对人体膝关节软骨磁共振T_2值的影响

目的基于MRT2map技术研究60d模拟失重条件对人体膝关节软骨T2值的影响。方法7名健康男性头低位-6°卧床60d,应用1.5T磁共振扫描仪进行卧床前后膝关节矢状位多回波多层面序列扫描,使用profile软件测量实验前后膝关节非承重、承重软骨,髌软骨的T2弛豫时间,采用配对t检验比较实验前后软骨T2值改变。结果卧床实验前后软骨T2值具有相同的空间分布形态。60d模拟失重条件下胫骨内外侧髁承重软骨、股骨非承重软骨卧床后软骨深部T2值有降低趋势,近表面T2值有升高趋势,但是只在胫骨外侧髁承重软骨距骨软骨下骨质0.3处、胫骨内侧髁承重软骨距骨软骨下骨质0.0,0.1处、股骨非承重软骨距骨软骨下骨质0.0处T2值降低有统计学差异(P<0.05);而胫骨内侧髁承重软骨距骨软骨下骨质0.4,0.5处T2值升高有统计学差异(P<0.05)。其余各处软骨实验前后T2值未见统计学差异。结论-6°头低位卧床60d前后膝关节软骨T2值空间分布相似,胫骨内外髁承重软骨、股骨非承重软骨深部T2值发生改变,但总体来看头低位卧床对膝关节软骨T2特性影响较小。

肌管细化是失重性肌萎缩结构和功能变化的基础

本文通过新生大鼠原代培养获取骨骼肌肌管,利用水平回转器模拟失重效应,通过F-actin/G-actin以及F-actin/pERK免疫细胞化学染色,观察研究了模拟失重对肌管形态、微丝及磷酸化ERK表达的影响。通过建立的航天飞行失重性肌萎缩的细胞学模型研究发现:回转后肌管变细,F-actin染色减弱伴有G-actin染色增强,同时pERK染色减弱。表明回转模拟失重条件下肌管发生萎缩、微丝解聚并伴随信号转导活性分子磷酸化ERK表达下降。

空间飞行条件下心肌细胞发生功能减退与微管解聚

空间飞行对心血管系统具有深远的影响.但是,目前关于心肌细胞如何对空间飞行条件发生响应尚未见报道.本研究报道了空间飞行对体外培养的心肌细胞结构与功能的影响.神舟六号飞船将原代培养的新生大鼠心肌细胞载入太空,并于发射后4h进行在轨激活.其中8个样品分别于发射后4,48以及96h进行在轨固定,并于飞船返回后进行细胞骨架的荧光染色观察;另外2个样品未进行固定,于飞船返回后进行心肌细胞收缩及分泌功能的分析;地面样品在实验室中进行平行处理.飞行115h结束后,与地面样品比较,飞行样品中心肌细胞的自发搏动位点显著减少,同时搏动位点中的细胞收缩频率明显加快,并失去同步性;对飞行样品培养液进行的放射免疫检测显示,飞行细胞的心钠素分泌水平下降59.6%.对固定样品进行的激光共聚焦显微图像分析显示,飞行细胞呈现时间依赖性的微管解聚,而微丝骨架的结构与分布没有明显变化.总之,上述结果提示,空间飞行诱发体外培养的心肌细胞发生功能减退和微管解聚,对于进一步研究空间心血管功能紊乱的机制提供了细胞学基础.

模拟微重力对大鼠嗜铬细胞瘤细胞蛋白酪氨酸硝基化的影响

目的研究微重力状态下活性氮自由基(RNS)对神经细胞蛋白质氧化修饰的影响。方法以大鼠嗜铬细胞瘤(PC12)细胞作为神经细胞模型,利用水平轴回转器模拟微重力效应。回转72 h后,对回转和对照组细胞进行一氧化氮合酶和硝基酪氨酸的免疫细胞化学染色分析,同时采用硝酸盐还原酶偶联法测定回转PC12细胞的一氧化氮(NO)水平,竞争性ELISA方法定量检测细胞硝基酪氨酸的水平。结果回转后PC12细胞诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和硝基酪氨酸免疫细胞化学染色均增强。回转后PC12细胞NO水平升高(P<0.01),蛋白质酪氨酸硝基化程度显著增加(P<0.01)。结论模拟失重可诱导PC12细胞NO的合成,增加蛋白质氧化损伤程度。

微重力和甲基化对细胞微管系统的调控

目的综述近几年来微重力和甲基化对细胞微管系统的调节。资料来源与选择国内外该领域的研究论文及综述。资料引用文献资料引用25篇。资料综合微重力及模拟微重力、甲基化对细胞微管及其相关蛋白的影响。结论微重力、甲基化对细胞微管及其相关蛋白的功能均有重要影响,但二者之间的关系还有待于进一步探讨。

重力对成体干细胞分化的影响

目的概述重力对成体干细胞分化影响的研究进展。资料来源与选择国内外本领域正式发表的研究论文和综述。资料引用引用文献20篇。资料综合重力对骨髓间质干细胞、造血干细胞和骨骼肌干细胞分化的影响。结论重力参与成体干细胞的分化,进一步丰富了干细胞分化调控理论,为干细胞定向诱导开辟一条新途径。

微重力下的氧化应激与药物防护

在航天飞行过程中,航天员受到多种物理因素和环境因素的影响,例如失重、超重、振动、噪声、辐射、昼夜节律改变、狭小的生活环境等。