我国生物制品生产用细胞外源因子污染情况检测

目的 对我国目前生物制品生产用细胞外源因子污染情况进行检测。方法 按照《中国生物制品规程》2000版规定的细胞外源因子检测方法，对我国生物制品生产用细胞进行细菌、真菌、支原体及一般外源病毒污染检测。结果 自2003—2006年3月间共检测了用于生物制品生产用细胞库细胞79株。结果显示，被检测的79株细胞中，支原体污染细胞10株，污染阳性率为12．7％；外源病毒污染细胞5株，污染率为6．3％；这5株外源病毒污染的细胞中，2株293细胞体外接种至人二倍体细胞后，致细胞形态明显异常；2株Vero细胞接种鸡胚后，致鸡胚全部死亡；1株Vero细胞接种乳鼠及成鼠后第7天，致接种动物全部死亡，组织病理学检查结果显示，接种待检细胞组小鼠脑组织有不同程度的病变。结论 目前我国生物制品生产用细胞存在一定程度的外源因子污染。

软琼脂克隆法与裸鼠体内接种法检测细胞致瘤性的比较

目的比较体外软琼脂克隆法与裸鼠体内接种法检测细胞致瘤性的敏感性及相关性。方法用软琼脂克隆法检测不同种类、不同来源的细胞的致瘤性,并与裸鼠体内接种法的结果进行比较。结果不同的细胞在体外软琼脂中形成细胞集落的能力及集落形态明显不同。肿瘤细胞在体外可形成肉眼可见的细胞集落,而人二倍体细胞及组织工程用细胞在体外不形成或仅形成极少的细胞集落克隆,其集落形成率与细胞代次没有相关性,在裸鼠体内亦不形成瘤。重组CHO细胞经过遗传改造后,有的在裸鼠体内的致瘤性减弱,但体外软琼脂克隆行为没有发生明显改变。从128至169代次的Vero细胞均可在体外软琼脂中形成不同的细胞集落克隆,高代次细胞的集落形成率明显高于低代次细胞,但所有检测代次的细胞在裸鼠体内均未形成瘤。结论用软琼脂克隆法检测细胞的致瘤性与裸鼠体内接种法不仅具有良好的相关性,而且敏感性高于裸鼠体内接种法。

STR图谱用于生物制品生产用人源细胞鉴别的研究

目的研究短串联重复序列（STR）图谱鉴别方法在生物制品生产用人源细胞质量控制中的应用。方法采用PCR一毛细管电泳分析方法，分别建立检测9个和16个人STIR位点的方法鉴别人源细胞，并对来自不同生物制品生产单位、不同传代水平的病毒性疫苗生产用人二倍体细胞株及基因治疗制品生产用的293细胞进行STR图谱的检测和比较。结果建立人源细胞株的STR图谱分析方法。13个单位提供的病毒疫苗生产用21株人二倍体细胞中，除1株细胞并非MRC-5细胞外，其他细胞均可认定为本细胞，且未发现交叉污染现象。而8个单位提供的12株基因治疗用293细胞的STIR图谱则存在明显差异，提示该类细胞可能存在来源、基因修饰改造背景不清及传代过程中遗传特性不稳定的因素。结论STR图谱分析灵敏度高、特异性强，可用于生产用人源细胞株／系间的鉴别。

大鼠抗——HB_s的单克隆抗独特型抗体杂交瘤细胞系的建立

用纯化的小鼠单克隆抗—HBs和纯化的大鼠多克隆抗—HBs免疫LOU/C大鼠,取免疫大鼠脾细胞与IR983F骨髓瘤细胞融合,获得两株(TD_1、TD_2)持续分泌抗—HBs的单克隆抗独特型抗体(抗—Id,Ab_2)杂交瘤细胞系。对TD_2进行了较全面的鉴定,TD_2的Ig类型为IgG,亚类为IgG_(2?),核型分析结果染色体数为65条。通过ELISA竞争抑制和中和抑制试验表明,TD_2所分泌的Ab_2既能被不同来源的抗—HBs所中和。又能被HBsAg.所竞争,且都呈现剂量依赖关系。将纯化的TD_2IgG免疫同系大鼠,诱导出了具有抗—HBs活性的抗—抗—独特型抗体(Ab_3)。上述结果证实,TD_2所分泌的单克隆抗体(McAb)是带有HBsAg表位内影像,具有HBsAg免疫源性的抗—HBs的单克隆抗—Id。

淋巴细胞免疫表型质控品的初步研究

目的研究液氮冻存对外周血单个核细胞(PBMCs)CD4+T和CD8+T百分比的影响,探索冻存PBMCs作为淋巴细胞免疫表型质控品的可行性。方法收集健康成人抗凝全血,用淋巴细胞分离液分离PBMCs后液氮冻存。定期复苏PBMCs检测CD4+T和CD8+T百分比,计算细胞存活率、回收率。并分析不同厂家试剂、复苏方法、固定时间等因素对CD4+T和CD8+T百分比的影响。结果液氮冻存0～12个月、12～24个月的PBMCsCD4+T和CD8+T百分比均保持在稳定水平。冻存12个月PBMCsCD4+T和CD8+T百分比的平均变异系数(CV)分别为14.5%和9.8%,细胞存活率为85.4%～94.3%,回收率33.3%～97.8%;冻存12～24个月PBMCs的CD4+T和CD8+T百分比的平均CV值分别为7.1%和6.5%,细胞存活率为88.3%～98.5%,回收率52.3%～101%。不同复苏方法和检测试剂的结果相对稳定,CD4+T和CD8+T百分比的平均CV值分别为8.1%和6.4%。复苏后的PBMCs经多聚甲醛固定可在48h内检测。结论液氮冻存的PBMCs有望作为淋巴细胞免疫表型测定的质控品。

不同试剂检测北京地区健康献血者淋巴细胞CD3^+CD4^+、CD3^+CD8^+百分比参考值调查

目的探讨北京地区健康献血者CD3+CD4+、CD3+CD8+百分比的参考值范围,并对国产和进口的淋巴细胞免疫表型双染试剂进行比较。方法收集北京地区500例健康献血者全血标本,分别使用进口和国产的CD3FITC/CD4PE和CD3FITC/CD8PE双染试剂,应用同一台流式细胞仪进行检测,并对不同性别、民族和年龄段的结果以及不同试剂的结果进行比较。结果进口试剂检测的北京地区健康献血者CD3+CD4+、CD3+CD8+百分比以及CD3+CD4+/CD3+CD8+的范围(95%可信限)分别为22.92～49.96、14.86～41.70、0.37～2.47,不同年龄段(18～29、30～39与40岁以上组)各项指标均值的差异有统计学意义(P<0.05),而不同性别的比较仅CD3+CD4+(%)的差异有统计学意义(P<0.01),比较汉族(n=484)与少数民族(n=16)中各项指标的差异均无统计学意义(P>0.05)。国产与进口试剂的检测结果显著相关,CD3+CD4+(%)、CD3+CD8+(%)以及CD3+CD4+/CD3+CD8+的r值分别为0.970、0.953、0.967。u检验结果显示CD3+CD4+(%)的差异无统计学意义(P>0.05),而CD3+CD8+(%)、CD3+CD4+/CD3+CD8+的差异有统计学意义(P<0.01)。结论初步建立北京地区健康献血者CD3+CD4+(%)、CD3+CD8+(%)的参考值,参考值受年龄、性别、民族、检测试剂和仪器等多种因素的影响。国产和进口淋巴细胞免疫表型双染试剂检测结果基本一致,相关性具有显著性。

小鼠抗—HBs的单克隆抗独特型抗体杂交瘤细胞系的建立及鉴定

用纯化的小鼠单克隆抗-HBs(Ab1)免疫同系BALB/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与Sp2/0骨髓细胞融合,获得两株(MA1、MA3)持续分泌抗-HBs的单克隆抗独特型抗体(抗-1d,Ab2)杂交瘤细胞系。对MA3做了较全面的鉴定。MA3的Ig类型为IgM,核型分析结果染色体数为106条。通过ELISA竞争抑制和中和抑制试验表明,MA3所分泌的Ab2既能被不同来源的抗-HBs所中和,又能被HBsAg所竞争,且都呈现剂量依赖关系。将纯化的MA3 IgM免疫同系小鼠,诱导出具有抗-HBs活性的抗-抗-独特型抗体(Ab3)。因此认为MA3所分泌单克隆抗体(McAb),可模似HBsAg,具有类似HBsAg的免疫原性,是一种带有HBsAg表位内影像的抗-HBs的单克隆抗-1d。

HIV抗体酶联免疫诊断试剂批内和批间精确性分析

目的 了解HIV抗体酶联免疫试剂批内和批间的精确性。方法 用同一批试剂多次检测同一样品和不同批次试剂分别检测同一样品 ,分别计算其批内和批间的变异系数 (CV) ,分析试剂的批内和批间的精确性。结果 用 1份样品对12家试剂的批内精确性分析结果显示 ,所有试剂的批内变异系数均在 15 %以内 ,符合要求 ,但不同试剂的变异系数不同 ,且有统计学差异。用 5份样品对 12家不同批次试剂的批间变异系数进行分析 ,在所得到的 6 0个变异系数中 ,仅有 3个变异系数小于或等于 15 % ,大部分试剂的批间变异系数均在 2 0 %以上。结论 HIV抗体酶联免疫试剂的批间精确性变异较大 ,其批间稳定性有待进一步提高。

HIV抗体确认试剂国家参考品的建立

目的建立评价HIV抗体确认试剂的国家参考品。方法从我国部分地区收集HIV感染者或可疑感染者以及非HIV感染者血浆样品,并对其进行HIV抗体、核酸以及抗体条带等检测,从中筛选出有代表性的样品组成参考品,用4家不同的HIV抗体确认试剂进行检测和标化。结果共筛选出27份样品组成HIV抗体确认试剂参考品,其中10份为HIV抗体确认阳性参考品,12份为HIV抗体确认阴性参考品,5份为HIV抗体不确定参考品。用4家不同的HIV抗体确认试剂标化12次,10份HIV抗体确认阳性参考品均检测为确认阳性;5份不确定参考品均检测为确认阳性或不确定,无检测为阴性者;12份阴性参考品10次均检测为确认阴性。结论该参考品可用于评价HIV抗体确证试剂的质量。

鼠抗HCV单克隆抗体研制及初步应用探讨

交联HCV 合成多肽抗原,用鼠一鼠杂交瘤技术获得8株稳定分泌抗HCV 的特异性单抗,分别命名为YLCV 系1—8。经初步研究结果表示,抗HCV 抗体阳性血清可抑制酶标YLCV-1和YLCY-5单抗与抗原的反应。抗原测定结果6份血清中有一份呈强阳性反应,由此提示单抗在HCV 抗体抗原检测系统中应用的可能性,同时为HCV 抗原成份的分析提供了必要的条件.

检测戊型肝炎病毒核酸的实时荧光聚合酶链反应法的建立

目的建立一种能快速、敏感地检测戊型肝炎病毒(HEV)核酸的实时荧光聚合酶链反应法(Real-timeRT-PCR)。方法基于HEVORF3保守区序列,设计引物和探针,从22对引物和4条探针中进行筛选,并对选出的引物和探针的浓度、反应体系、反应条件、核酸抽提方法等进行优化。采用常规套式RT-PCR和本研究建立的实时荧光RT-PCR检测不同样品,比较两种方法的特异性和敏感性。结果优化出1对引物和探针的组合。优化的30μl反应体系中,上、下游引物浓度均为0.10mmol/L,探针浓度为0.20mmol/L,Taq酶的浓度为3U,AMV逆转录酶浓度为2U。优化的反应条件为:50℃30min;95℃3min;95℃10s,50℃30s,72℃60s,5个循环;95℃10s,57℃40s,40个循环。初步检测结果显示,该方法与常规套式RT-PCR特异性符合率为100%,两种方法检测HEV1型样品的敏感性均为104,检测人和猪的HEV4型样品时,实时荧光RT-PCR敏感性均为104,明显高于常规套式RT-PCR的103和102。结论所建立的检测HEV核酸的实时荧光聚合酶链反应法具有简便、快速、敏感性较高以及不易被污染等优点,具有一定的临床应用潜力。

VIDAS HIV Duo Assay试剂的特异性及敏感性

目的评价HIV抗原/抗体联合检测快速法(VIDAS HIV Duo Quick)和超敏法(VIDAS HIV Duo Ultra)试剂的特异性及敏感性。方法用这2种试剂和HIV抗体参比试剂,分别检测287份HIV感染或疑似感染者样品、1240份非HIV感染者血清/血浆样品,对与参比试剂检测结果不一致样品,进行抗体的确认及HIV p24抗原和RNA的检测,并比较其特异性和敏感性。用这2种试剂和HIV-1p24抗原参比试剂,分别检测3株病毒培养上清的系列稀释样品,并比较其检测p24抗原敏感性的差异。结果共检测1277份HIV抗体阴性样品和250份HIV抗体阳性样品,与参比试剂相比,快速法试剂的特异性为99.45%,敏感性为100%,而超敏法试剂的特异性为99.14%,敏感性为99.20%。两种试剂检测病毒株培养上清的敏感性均不低于HIV-1p24抗原参比试剂,且能检出HIV感染窗口期样品。结论这2种试剂在增加HIV p24抗原检测的情况下,对HIV抗体检测的特异性和敏感性均没有明显降低,并且能检测出HIV感染窗口期样品。

北京地区部分人类免疫缺陷病毒基因型分析

To investigate HIV genotypes isolated from blood donors in Beijing, the samples positive for anti-HIV antibody with ELISAwere confirmed by HIV blot. All 26 samples were confirmed positive for anti-HIV antibody. RNA from those samples were detected with RT-PCR. 20 of them were positive for HIV RNA. The purified PCR products were cloned. The sequences were determined and analyzed. The results showed that 10 of 20 isolates were CRF BC, 9 of them were genotype B, 1 of them were CRF AE. 6 of 9 genotype B belong to B’(Thailand B), the remaining 3 isolates may belong to western genotype B. The results indicated that several different genotypes of HIV which are predominant in China may exist in Beijing. This result may be helpful for the development of HIV vaccine in Beijing.

戊型肝炎病毒感染免疫研究进展

戊型肝炎病毒(hepatitis Evirus,HEV)是引起戊型肝炎的病原体.在发展中国家戊型肝炎是一个重要的公共卫生问题,我国是HEV的流行区.本文就近期HEV感染后的体液免疫反应、细胞免疫反应、免疫损伤机制的研究以及HEV疫苗研制的进展进行综述.

人乳头瘤病毒中和抗体检测方法的研究进展

人乳头瘤病毒疫苗已成为预防宫颈癌的最根本手段,而疫苗成功的关键是诱导有效的体液免疫,产生具有保护作用的中和抗体。本文就目前几种中和试验方法的原理及其优缺点进行综述。

酶联免疫斑点技术的标准化研究

酶联免疫斑点技术因其灵敏度高,操作相对简便,广泛应用于疫苗的细胞免疫评价。本文对该方法的特点、标准化研究以及网络实验室的发展状况进行综述。

疫苗效价检测方法的研究

本文对现行疫苗效价的检测方法及其要求进行了分析,并对新的检测方法,如假病毒中和试验、转基因动物实验和实时定量PCR在效价检测中的应用进行了介绍。

人颗粒酶B的表达及抗原性初步分析

目的在原核系统表达人颗粒酶B(GrB)酶原型及活性型基因,并分析表达产物的抗原性。方法从人外周血淋巴细胞中抽提RNA,用RT-PCR方法扩增人颗粒酶B序列,将其克隆至pGEX-5x-1表达质粒,与GST进行融合表达,用SDS-PAGE及Western blot对表达产物进行分析。结果所克隆的GrB序列与已报道的从人体分离出的GrB完全一致。酶原型和活性型GrB与GST的融合蛋白以包涵体的形式表达,其大小与预期结果一致,并能与GrB特异性抗体发生结合反应。结论已成功构建了GrB原核表达系统,酶原型及活性型GrB均具有抗原性。

戊型肝炎病毒Ⅳ型ORF2蛋白在汉逊酵母中的表达

为了寻求新型表达系统来研制戊型肝炎基因工程疫苗,利用甲基营养型汉逊酵母(Hansenulapolymorpha)系统表达戊型肝炎病毒(HepatitisEvirus,HEV)Ⅳ型结构区ORF2编码蛋白第112-607氨基酸片段。为实现目的基因在汉逊酵母中的高效表达,根据汉逊酵母偏爱密码子优化设计目的基因,用搭桥PCR法合成优化后的基因序列,并克隆到多拷贝表达载体上,转化汉逊酵母营养缺陷宿主菌ATCC26012(Ura3-),在选择培养基上培养,运用PCR法筛选得到携带外源基因的重组菌株,然后用含甲醇的培养基诱导表达,对表达产物进行SDS-PAGE、ELISA和Westernblot检测和鉴定。SDS-PAGE实验结果表明目的蛋白分子量约为56kD,表达量占菌体总蛋白的12%;ELISA检测结果表明表达产物为具有免疫反应性的HEVORF2蛋白,ELISA效价最高可达1∶2048,目的蛋白表达量随着基因拷贝数的增加呈升高的趋势;Westernblot鉴别实验结果证实表达产物与HEV多抗有特异性抗原抗体结合反应。HEV结构区ORF2蛋白在汉逊酵母中的成功表达,为研制基因工程戊型肝炎疫苗奠定了基础。

戊型肝炎病毒各生物标志物之间关系分析

目的分析戊型肝炎病毒（HEV）各生物标志物之间关系以及各标志物在早期诊断中的作用。方法从临床收集急性散发性肝炎患者的血清，用酶联免疫（EIA）试剂检测HEV IgG抗体、IgM抗体和抗原，用实时荧光RT-PCR方法检测核酸，比较其相关关系。结果在121例急性散发性肝炎中，HEV IgM抗体阴性者为51例，其中抗原或／和核酸阳性者占45．1％；IgM抗体阳性者70份，其中抗原或／和核酸阳性者占67．1％。HEV IgG抗体在IgM抗体、抗原和核酸均阴性的患者中阳性率为53．6％；在IgM阴性而抗原或／和核酸阳性者中阳性率为73．9％；在IgM阳性的HEV感染者中阳性率为92．9％。HEV抗原与核酸的符合率为81．8％，抗原与IgM抗体的符合率为58．7％，而IgM抗体与核酸的符合率为53．7％。结论在HEV感染的早期诊断中增加抗原和核酸的检测有助于提高检出率。