结核分枝杆菌H37Rv两种抗原Ag85b、HspX的制备及其与佐剂的联合应用

目的用分子生物学方法制备H37Rv的两种抗原Ag85b、HspX,通过与铝佐剂和CpG佐剂联用免疫小鼠进行初步药理学实验以观察其生物学活性。方法常规方法分别构建重组表达质粒pET30a-Ag85b和pET30a-HspX,内切酶鉴定目的片段后两种质粒分别转化BL-21大肠杆菌,经异丙基-β-D-硫代半乳糖苷诱导后分别产生两种蛋白;用阴离子交换柱Source30、QHP以及疏水层析柱对两种蛋白进行纯化;蛋白测序进行鉴定。纯化后的两种蛋白分别与铝佐剂和CpG佐剂联用(Ag85b,Ag85b+Al,Ag85b+CpG,Ag85b+Al+CpG;HspX,HspX+Al,HspX+CpG,HspX+Al+CpG),免疫C57/BL小鼠,同时设置生理盐水对照组,取脾细胞进行酶联免疫斑点实验(ELISPOT)检测干扰素-γ(IFN-γ)的分泌;同时进行淋巴细胞增殖实验检测脾淋巴细胞经体外刺激后的增殖情况。结果成功构建了两种重组表达质粒pET30a-Ag85b和pET30a-HspX,成功诱导表达了两种蛋白;经过纯化,两种蛋白纯度均达到95%;经鉴定两种蛋白纯化产物的N端15个氨基酸序列与目的序列相同;Ag85b+CpG、Ag85b+Al和Ag85b+CpG+Al组经Ag85b(80μg/ml)体外刺激后分泌IFN-γ显著升高,与生理盐水组比较差异具有显著性(P<0.05);HspX+CpG+Al组经HspX(80μg/ml)体外刺激后分泌IFN-γ显著升高,与生理盐水组比较差异具有显著性(P<0.05)。结论成功表达并纯化了结核分枝杆菌H37Rv的两种抗原Ag85b和HspX,与铝佐剂和CpG佐剂联用后成功刺激小鼠产生了细胞免疫反应,证实了两种重组蛋白的生物学活性,为下一步药效学评估奠定了基础。

BCG-CpG-DNA对A群脑膜炎球菌多糖疫苗的免疫佐剂作用

目的探讨免疫佐剂BCG-CpG-DNA对A群脑膜炎球菌多糖疫苗的作用。方法将不同剂量(5、10、100μg)的免疫佐剂BCG-CpG-DNA与A群脑膜炎球菌多糖疫苗直接混合后,皮下免疫小鼠,与未添加佐剂疫苗比较,ELISA法检测抗原特异性IgG抗体水平,并分析抗体亚类IgG1和IgG2a的水平。结果BCG-CpG-DNA能提高A群脑膜炎球菌多糖疫苗特异性抗体IgG水平,并能促进抗原特异性抗体亚类的产生,其中佐剂中、高剂量(10、100μg)实验组IgG、IgG2a水平与未加入免疫佐剂疫苗之间差异有统计学意义。结论BCG-CpG-DNA对A群脑膜炎球菌多糖疫苗有免疫佐剂作用。

耻垢分枝杆菌疫苗对小鼠巨噬细胞产生一氧化氮的影响

目的探讨耻垢分枝杆菌疫苗对小鼠腹腔巨噬细胞产生一氧化氮的影响。方法将Balb/c小鼠随机分成生理盐水对照组和耻垢分枝杆菌疫苗低、中、高剂量组,分别注射生理盐水和不同剂量的耻垢分枝杆菌疫苗。取小鼠腹腔巨噬细胞体外培养,化学显色法测定培养上清中一氧化氮的含量。结果生理盐水对照组和耻垢分枝杆菌疫苗低、中、高剂量组产生的一氧化氮分别为(3.50±3.11)、(16.63±6.47)、(13.97±6.20)和(7.55±2.26)ng/ml,不同剂量疫苗免疫小鼠产生的一氧化氮水平均显著高于对照组(P<0.01)。结论耻垢分枝杆菌疫苗可促进小鼠巨噬细胞产生一氧化氮。

国内外卡介菌的分子遗传学特性

目的比较我国生产用卡介菌上海菌株与国际常用卡介菌亚株(巴斯德1173P2株、法国F6株、丹麦1331株、丹麦2株、日本172株、Connaught)在分子遗传学上的差异。方法应用PCR和多重PCR方法,对国内外不同卡介菌的各缺失区(RD1、RD2、RD8、RD14、RD16、nRD18、RDDenmark/Glaxo)、插入序列IS6110拷贝数及基因座SenX3-Regx3串联重复序列拷贝数进行检测。结果我国生产用卡介菌上海菌株(BCG Chinese)缺失RD1和RD2,不缺失RD8、RD14、RD16、nRD18及RDDen-mark/Glaxo,含有1个IS6110插入序列,SenX3-Regx3基因座有3个串联重复序列,PCR产物为353bp;巴斯德1173P2株缺失RD1、RD2、RD14和nRD18,含有1个IS6110插入序列,SenX3-Regx3基因座有2个串联重复序列;法国F6株缺失RD1、RD2和nRD18,含有1个IS6110插入序列,SenX3-Regx3基因座有2个串联重复序列;丹麦1331株缺失RD1、RD2及RDDenmark/Glaxo,含有1个IS6110插入序列,SenX3-Regx3基因座有2个串联重复序列;丹麦2株与丹麦1331株相似,只是SenX3-Regx3基因座有2个串联重复序列和3个串联重复序列并存的现象;日本172株只缺失RD1,RD16只显示401bp的产物,含有2个IS6110插入序列;Connaught株缺失RD1、RD2、RD8及nRD18,含有1个IS6110插入序列,SenX3-Regx3基因座有1个串联重复序列。结论我国生产用卡介菌上海菌株与国外其他卡介菌亚株在分子遗传学特性上有一定的差异。

我国生产用卡介菌的传代稳定性

目的研究我国生产用卡介菌上海株在传代过程中分子遗传学特性的稳定性。方法应用多重PCR法,对我国生产用卡介菌上海株工作种子批及其不同代次菌的各缺失区、插入序列IS6110及基因座SenX3-RenX3串联重复序列拷贝数进行检测。结果我国生产用卡介菌上海株的工作种子批及其第6、9、12代菌均缺失RD1、RD2,未缺失RD8、RD14、RD16、nRD18及RDDenmark/Glaxo;含有1个IS6110插入序列和3个SenX3-RenX3基因座串联重复序列。结论我国生产用卡介菌上海株在传12代以内,其分子遗传学特性是稳定的。

结核病高危人群预防用无细胞耻垢分枝杆菌疫苗的研制

目的研制结核病高危人群预防用无细胞耻垢分枝杆菌疫苗(MS疫苗)。方法耻垢分枝杆菌培养物经多次洗涤后,制备所需浓度的菌悬液,高压匀浆后,经高压灭菌、稀释、分装、冻干,制成MS疫苗。将结核杆菌感染的豚鼠随机分为A组(接种疫苗8.7μg/次)、B组(接种疫苗17.5μg/次)和C组(接种生理盐水),观察疫苗对结核杆菌感染豚鼠的保护作用。结果MS疫苗浓度确定为每支蛋白含量为17.5μg(0.25mg湿菌)。疫苗具有良好的安全性,且可有效抑制或杀死豚鼠体内的结核杆菌,减轻豚鼠各脏器的病变程度。结论已成功制备MS疫苗,其对结核杆菌感染动物有较好的预防效果,有望成为结核病高危人群预防用疫苗。

高特异性长双歧杆菌多克隆抗体的制备

目的制备高特异性长双歧杆菌多克隆抗体,为长双歧杆菌的免疫学检测提供参考。方法以破碎的长双歧杆菌细胞碎片为抗原免疫小鼠,制备抗血清;利用偶联相同抗原的磁珠,分离纯化长双歧杆菌多抗,分别采用间接ELISA、SDS-PAGE和点杂交法检测纯化多抗的效价、纯度和交叉反应性。结果所制备的纯化多抗效价约为1∶1500,回收率约为80%,纯度可达83%。纯化的多抗有效消除了与金黄葡萄球菌的非特异性交叉反应。结论已制备出高特异性的长双歧杆菌多克隆抗体,可用于长双歧杆菌制剂的菌体检测。

分光光度法测定炭疽疫苗的浓度

目的应用分光光度法测定炭疽疫苗的浓度。方法确定分光光度法测定炭疽疫苗的测定波长及线性范围,并对样品稳定性及方法的重复性进行分析。结果确定600nm作为检测波长;炭疽疫苗浓度在(0.25～1.25)×108个/ml之间时,A600值与菌液浓度之间具有良好的相关性(r=0.9991,自由度=3,P<0.01);样品经甲醛处理后稳定性增强;该方法具有良好的重复性。结论分光光度法可用于炭疽疫苗浓度的测定,可替代比浊法或作为炭疽疫苗浓度测定的确证方法。

四唑鎓盐法快速检测布鲁杆菌疫苗活菌含量的建立

目的通过四唑鎓盐(XTT)法检测布鲁杆菌疫苗的活菌含量,探讨XTT法快速检测布鲁杆菌活菌含量的可行性。方法将XTT法运用于布鲁杆菌疫苗活菌含量的检测,通过已知活菌浓度的布鲁杆菌液,制备XTT法的吸光值与布鲁杆菌苗活菌含量的关系参比曲线,并根据制备的参比曲线同样运用XTT法检测未知浓度的104M菌液的活菌量,比较传统活菌集落计数(CFU)法与XTT法两者检测布鲁杆菌活菌含量的相关性。结果 XTT法检测布鲁杆菌疫苗的最佳时间应在4 h左右,在一定范围内XTT法所测得的吸光值与细菌活菌含量有较好的相关性,相关系数r=0.997。运用10瓶布鲁杆菌疫苗,通过XTT法与CFU法检测其活菌含量,两者结果相关性较好,Spearman相关系数为0.879,P=0.001。结论 XTT法能在一定活菌浓度范围反应布鲁杆菌疫苗活菌含量,可为快速检测布鲁杆菌活菌含量提供一种新的参考方法。