重组抗肿瘤抗病毒蛋白乐复能质控方法与质量标准的建立

目的:建立重组抗肿瘤抗病毒蛋白乐复能(novaferon)的质控方法和质量标准。方法:以WST-1染色法检测Daudi细胞增殖,测定乐复能的抗肿瘤细胞增殖活性;以WISH细胞病变抑制法测定乐复能抗病毒活性;乐复能以胰蛋白酶酶切后,用HPLC分析肽图;其余检测项目按《中华人民共和国药典》(三部)2005年版的规定进行。结果:3批乐复能原液和成品的抗肿瘤比活性均≥2.0×106U/mg、抗病毒比活性均≥1.0×109IU/mg。3批乐复原液的HPLC肽图与参考品一致,乐复原液的蛋白含量、纯度、分子质量、等电点、末端氨基酸序列等指标及成品的细菌内毒素、苯甲酸含量、乙腈残留量等指标均符合规定。根据检定结果建立了乐复能的质量标准。结论:建立的质控方法和质量标准可以保证乐复能的安全、有效和质量可控,可用于乐复能的常规检定。

重组人粒细胞集落刺激因子的氨基酸组成分析

目的分析重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)的氨基酸组成。方法应用氨基酸分析仪,采用离子交换色谱茚三酮柱后衍生法对rhG-CSF进行氨基酸组成分析。样品采用常规酸水解处理后,以氨基酸标准溶液外标法进行测定。结果系统对标准溶液各个氨基酸组分均有良好的分离。3支rhG-CSF样品的9次测定结果除Met外,均较接近,变异系数较小,与理论值基本一致。结论采用氨基酸自动分析仪柱后衍生法分析氨基酸组成重复性好,误差较小,可用于rhG-CSF的质量控制。

血管内皮生长因子抑制剂生物学活性检测方法的建立

目的建立血管内皮生长因子抑制剂（VEGF Trap）生物学活性检测方法。方法利用HEK293/D9/Flt-18R（al-pha）/Flt-IL18R（beta）,clone V3H9细胞系,通过荧光素酶检测系统（Steady-Glo Luciferase Assaysystem）进行VEGF Trap的生物学活性检测,用VEGF Trap参考品计算供试品的相对百分效价,并对该方法进行精密性和准确性验证。结果VEGF Trap供试品及参考品在该方法中均存在量效关系,且符合四参数方程式：y=（A-D）/[1＋（X/C）^B]＋D。3批VEGF Trap原液和6批成品经3次测定,相对百分效价的平均值在（90.00±2.40）%～（116.77±16.50）%之间,变异系数均小于15%。1批VEGF Trap原液及成品经3次测定,回收率分别为（90.40±2.67）%和（117.20±18.12）%。结论已成功建立VEGF Trap生物学活性检测方法,该方法重复性好,准确性高,可作为VEGFTrap生物学活性的常规检测方法。

重组人干扰素β1b活性测定国家标准品的研制

目的研制重组人干扰素β1b(rhIFNβ1b)生物学活性测定国家标准品。方法按《中国药典》三部(2005版)要求检测rhIFNβ1b标准品原液各项质量指标,以rhIFNβ1b国际标准品为标准进行协作标定,并检测其稳定性。结果rhIFNβ1b国家标准品经检测,外观、无菌试验合格,水分含量为0.8%,分装精度为0.44%。该标准品经3家实验室协作标定24次,几何平均生物学活性为7.18×104IU/支,平均生物学活性的95%可信区间为6.87×104～7.52×104IU/支,单次测定的95%参考值范围为5.76×104～8.68×104IU/支,平均可信限率为4.36%。在温度为-20、4、25和37℃条件下放置12个月,其生物学活性保持稳定。结论该批rhIFNβ1b活性测定国家标准品各项指标均符合要求,可作为国家标准品使用,生物学活性定为7.2×104IU/支,批号为08/01。

绿脓杆菌外毒素A功能片段重组蛋白GP38质控方法和质量标准的建立

目的建立人性腺激素释放激素类似物—绿脓杆菌外毒素A功能片段重组蛋白GP38的质控方法和质量标准。方法采用HeLa细胞/结晶紫比色法测定GP38蛋白的生物学活性,并进行精密性和回收率验证;反相高效液相色潽法(RP-HPLC)测定其纯度,用自编CPM软件进行肽图比较分析;其他检测项目按《中国药典》三部(2005版)规定进行。结果GP38蛋白生物学活性测定方法经验证,原液试验内变异系数(CV)为10%,试验间CV值为20%;成品试验内CV值为12%,试验间CV值为21%。用该法对GP38蛋白原液和成品进行检测,其生物学活性分别为(3736±483)和(1777±260)U/ml。原液经RP-HPLC分析,纯度为(97.1±0.2)%,符合其质量标准大于95.0%的规定。用自编CPM软件分析肽图结果显示,相同酶切条件重复检测的相似度大于0.99,不相同次酶切、相同条件重复检测的相似度大于0.90。其他各项检测结果均符合《中国药典》三部(2005版)的相关要求。结论所建立的质控方法和质量标准可用于GP38蛋白产品的常规检定。

重组人血清白蛋白-干扰素α2a融合蛋白质控方法与质量标准的建立

目的:建立重组人血清白蛋白-干扰素α2a融合蛋白(rHSA-IFNα2a)的质控方法和质量标准。方法:分别使用抗HSA抗体和抗IFNα2a抗体、采用免疫印迹法对成品进行鉴别试验,采用WISH细胞病变抑制法测定成品和原液的生物学活性,原液以胰蛋白酶酶切后,用HPLC分析肽图,其余项目按2010年版中国药典(三部)的规定进行检测。结果:样品与抗HSA抗体和抗IFNα2a抗体均呈阳性反应,比活性>1.5×105 IU.mg-1,其肽图与参考品的一致,其余项目均符合2010年版中国药典(三部)的规定,根据检测结果建立了rHSA-IFNα2a的质量标准。结论:建立的质控方法和质量标准可以保证rHSA-IFNα2a的安全、有效和质量可控,可以用于rHSA-IFNα2a的常规检定。

应用ELISA测定睫状神经营养因子中卡那霉素残留量

目的：建立ELISA检测卡那霉素残留量的方法并进行方法学验证,用于重组技术产品的质量控制。方法：采用间接竞争ELISA方法,样本中残留的卡那霉素将和微孔板上预包被的偶联抗原竞争抗卡那霉素抗体,加入酶标二抗后,用3,3,5,5-四甲基联苯胺（TMB）底物显色,样本吸光值与残留卡那霉素的含量成负相关,用酶标仪进行检测并用SOFT MAX分析软件进行分析。结果：ELISA方法测定卡那霉素残留量在0.5~40.5 ng.mL-1范围内线性良好,且符合四参数方程式：y=（A-D）/[1＋（X/C）B]＋D,r2≥0.99;板内变异小于15%,板间变异小于20%,实验重复性好,加标回收率在80%~120%之间;该方法检测与庆大霉素、盐酸四环素、链霉素和氨苄西林药物未显示交叉反应。应用该法对1批睫状神经营养因子（CNTF）原液的卡那霉素残留量进行测定,结果表明,每人用剂量CNTF（100μg）卡那霉素残留量小于0.5 ng。结论：该方法具有灵敏度高、操作简便、检测迅速等特点,可用于重组技术产品中卡那霉素残留量的检定。

Exendin-4的研究进展

糖尿病是威胁人类健康的重大疾病,Exendin-4是一种从墨西哥巨蜥蜴的毒液中分离得到的含39个氨基酸的多肽,与GLP-1具有53%的序列同源性,其不但能促进胰岛素分泌,而且具有稳定性好、半衰期长的优点,在糖尿病等治疗方面具有广阔的前景。本文就Exendin-4结构、性质、功能等方面的研究进展作以综述。

人源化叶酸受体α抗体质控方法的建立

目的建立人源化叶酸受体α抗体的质控方法。方法应用基于表面等离子体共振(Surface plasmon resonance,SPR)技术的BIAcore3000系统测定人源化叶酸受体α单抗与重组人叶酸受体α的亲和力,从而反映该抗体的功能;采用ELISA法测定其抗原结合力;SDS-PAGE和SEC-HPLC测定其纯度;紫外分光光度法测定其蛋白含量;毛细管等电聚焦电泳法测定等电点;其他各项指标检测按《中国药典》三部(2005版)要求进行。结果人源化叶酸受体α单抗成品的平均相对百分效价为105%,RSD为6.0%。单抗成品及参考品与叶酸受体的结合力均存在量效关系,且符合四参数方程式:Y=(A-D)/[1+(X/C)B]+D,其曲线相关系数在0.98以上,成品经3次测定,相对抗原结合力平均值为97%,RSD为25%。还原SDS-PAGE分析显示,单抗成品的IgG重链和轻链百分比为98.2%;非还原SDS-PAGE分析显示,完整IgG百分比为96.7%;SEC-HPLC分析显示,单抗成品单体为99.1%,聚合体为0.9%。其他各项指标均符合《中国药典》三部(2005版)要求。结论已初步建立了人源化叶酸受体α抗体的质控方法,为该制品的质量控制奠定了基础。

人源化抗叶酸受体抗体的抗原结合活性测定

目的:采用直接ELISA法检测人源化抗叶酸受体抗体的抗原结合活性。方法:以固定量的重组人叶酸受体a做包被抗原,辣根过氧化酶标记的抗人IgG(H+L)为二抗,直接测定不同浓度参比品和供试品与抗原的结合活性,通过数据处理软件对结果绘图,根据供试品及参比品EC50值计算供试品的相对结合力。结果:同一批次的3支供试品分别经3次测定,相对结合活性分别为参比品的(80.61±12.19)%,(88.82±12.70)%,(103.57±6.07)%,平均值(91.0±13.72)%。3次试验的RSD分别为15.12%,14.30%,5.86%。结论:直接ELISA法精密性良好,结果客观,影响因素少,可用于人源化叶酸受体抗体抗原结合活性的常规检测。