人源血管内皮生长因子突变体Ⅱ的克隆表达、分离纯化及初步鉴定

构建人源血管内皮生长因子突变体hVEGF121Ⅱ的重组原核表达质粒,获得hVEGF121Ⅱ蛋白用于制备抗血管生成作用更强的抗肿瘤疫苗。利用PCR技术,在已构建的hVEGF121Ⅰ突变体的基因末端引入热休克蛋白mHSP70的407-426两段串联重复序列的编码基因,PCR产物经Hind III和Nco I双酶切后连接到经同样限制性内切酶切过的原核表达载体pET-28a(+)上,转入大肠杆菌菌株BL21(DE3)中,乳糖诱导表达,超声破碎菌体,包涵体经洗涤、溶解、稀释复性、离子交换层析得到目的蛋白hVEGF121Ⅱ,Western-blot鉴定。结果成功构建了hVEGF121Ⅱ蛋白的表达质粒pET-28a(+)-hVEGF121Ⅱ,重组菌株经乳糖诱导后,目的蛋白表达量占全菌蛋白的62%,分离纯化后纯度达到95%,hVEGF121Ⅱ蛋白的单体和二聚体都可以和VEGF抗体结合。重组hVEGF121Ⅱ蛋白的表达成功为进一步对其进行免疫学研究奠定了基础。

一种带有组氨酸标签的抗糖尿病疫苗的构建、表达、纯化及鉴定

利用组氨酸标签系统提高抗糖尿病疫苗HSP65-6P277融合蛋白的产量,简化纯化工艺。通过PCR方法,在融合蛋白HSP65-6P277的N端添加6个组氨酸标签后,定向克隆到pET28a原核表达载体中成功构建了组氨酸标签融合表达载体pET28a-HIS-HSP65-6P277。通过乳糖诱导,融合蛋白HIS-HSP65-6P277在大肠杆菌BL21(DE3)宿主中以可溶形式表达,镍柱亲和层析纯化后,经SDS-PAGE和Western blotting鉴定表明表达产物是约70 k具有6个组氨酸标签肽的融合蛋白;分离纯化融合蛋白的时间从原来的15～20 d缩短为2～3 d,产量提高到56 mg/L。组氨酸标签系统可以较好的简化抗糖尿病疫苗HSP65-6P277融合蛋白的纯化工艺,提高产量。