中药效应物质基础和质量控制研究的思路与方法

结合本实验室近几年的研究实例,提出中药效应物质基础和质量控制研究的思路即以中药的整体观和多成分、多靶点协同作用特点为切入点,充分考虑中药有效成分在体内过程中的变化,综合运用多学科知识和现代先进的分离分析手段,构建中药及其复方复杂体系的吸收、分布、与靶细胞结合、代谢和代谢组学的体内外研究技术平台,系统阐明中药发挥作用的体内效应成分(群),建立与临床药效相关的、体内真正起效的、符合中药多成分、多靶点协同作用特点的中药质量控制方法,构建符合用药实际的中药质量控制新体系。

基于中医药特点的中药体内外药效物质组生物/化学集成表征新方法

中药药效物质基础研究一直是中医药现代化的关键问题之一。近几十年来,中药药效物质研究虽已取得了长足的进步,但还存在明显不足,符合中药特点的药效物质研究关键技术体系尚不完善。作者及其研究团队针对中药药效物质基础的国内外研究现状,集成多学科的理论和技术,在学术思想、研究思路和研究方法等方面进行了探索,通过近十年的系统研究,建立了基于整体观、符合中医药特点和具有普适性的中药复杂药效物质研究关键技术与方法学体系,包括中药多组分表征技术、中药生物体内动态药效物质研究技术、生物捕集-化学集成表征新技术、中药多成分整合作用研究技术、适宜于中药特点的多指标质量控制技术。研究成果为中药药效物质基础及作用机制研究提供了技术支撑。

常用十字花科药用植物中芥子碱的分布研究

十字花科植物中的芥子碱是一种非常有价值的天然抗氧剂,在抗衰老药物的研究中受到了许多学者的重视。为了考察芥子碱在我国药用植物中的分布情况,采用反相高效液相色谱法测定了我国常用的4种十字花科药用植物白芥子、莱菔子、葶苈子、黄芥子中该成分的含量。采用的色谱柱为A lltim a Pheny l柱(250mm×4.6mm i.d.,5μm);流动相:3%醋酸溶液和乙腈的混合溶液,梯度洗脱;检测波长:326nm;柱温:25℃。该法快速,准确度高,重现性好,方法的建立不仅为上述4种药材的质量监测提供了有效的定量分析方法,而且对于芥子碱的深入研究具有重要意义。

内标校正法在中药栀子多成分同时定量分析中的应用

目的:建立一种方便实用的中药栀子的质量评价方法。方法:建立西红花苷-1与其他西红花酸类成分的内标校正因子(fkm)并考察其系统适应性,测定西红花苷-1的含量,用fkm计算其它西红花酸类成分的含量。结果:内标校正法计算与实测分析结果无显著差异。结论:内标校正法在中药栀子定量分析中具可行性。

靶分子亲和-质谱联用技术应用于中药等复杂体系中活性成分的筛选

如何从中药等复杂体系中快速、高效地筛选出活性成分,是现代药物研究的重要领域之一。基于光学检测或放射性检测的高通量药物筛选模式,在应用于中药等复杂体系时,由于没有成分分离过程,易产生假阳性或假阴性结果;而采用传统的成分分离、结构鉴定、活性测试的筛选模式,则存在工作量大、周期长、活性成分易丢失等缺陷。靶分子亲和-质谱联用技术是利用药物靶点与配体的亲和作用或靶酶的催化作用将活性成分从复杂体系中抽提出来,并用质谱对其进行检测及活性评价的一种筛选技术。本文对适用于中药等复杂体系中活性成分筛选的靶分子亲和-质谱联用技术进行了综述,主要介绍直接进样质谱筛选技术、膜分离-质谱联用技术、分子排阻色谱-质谱联用技术、固定化靶蛋白-质谱联用技术、前沿亲和色谱-质谱联用技术、高效液相色谱恒流在线反应-质谱联用技术等的原理及其应用,为中药活性成分筛选提供技术参考。

代谢组学与中医药现代研究

代谢组学是系统生物学的关键技术和研究方法,在方法学上具有融整体、动态、综合、分析于一体的特点,符合中医治疗疾病和中药作用的整体性原则。中医病证引起代谢物组的共性分析和生物标记物的发现,可促进“证”本质的研究和中医辨证的科学化和定量化,深层次理解中医脏象理论,预测疾病的发生,反应肠道内生态环境状况以及整体性评价中药及复方综合疗效、安全性和作用机制。中药体内代谢物组的分析,可促进中药效应物质基础的阐明,建立科学的中药质量控制方法,确保临床中药产品的安全、有效。代谢组学和中医药学的有效组合,一定能进一步加快中医药学研究的现代化进程。

中药萹蓄的质量标准研究

目的：建立中药篇蓄的质量标准.方法：采用RP—HPLC方法，以0．1％甲酸（A）-乙腈（B）为流动相，梯度洗脱，流速1．0mL·min^-1，检测渡长352nm，测定篇蓄中主要黄酮类成分杨梅苷、篇蓄苷和槲皮苷的含量，并以槲皮苷为对照品进行“一测多评”评价：结果：杨梅苷、篇蓄苷、槲皮苷的线性范围分别为5．64～282μg·mL^-1、4．60～230μg·mL^-1和4．48～224μg·mL^-1，线性关系良好；平均回收率分别为98．2％（RSD=1．1％）、102．1％（RSD=0．6％）和98．9％（RSD=2．9％）：“一测多评”的计算结果较实测值接近，达96．2％～101．2％：结论：本标准能准确定量3种黄酮类成分，可用于篇蓄药材的质量控制.

萝藦科植物中甾类成分的抗肿瘤作用

甾体类化合物广泛存在于萝藦科植物中,具有显著的生理活性,包括抗肿瘤活性。近年来关于该类化合物体内外抗肿瘤作用的研究报道越来越多。综述以香加皮和白首乌为主的萝藦科植物药中甾体类成分的抗肿瘤活性及机制的研究进展,为进一步阐明该类化合物的药理机制及相关药物的研发提供参考。

高效液相色谱法测定忍冬藤和叶中8种活性成分

建立了多波长分析忍冬藤和叶中化学成分含量的高效液相色谱分析方法,色谱柱为Aglient Zorbax80A,Extend-C18(4.6mm×250mm,5μm);流动相为0.3%甲酸-乙腈,梯度洗脱;流速为1.5mL/min;检测波长为240、330、360nm;柱温38℃。各指标成分的检出限均低于0.29mg/L;精密度RSD均低于2.29%;标准加入的回收率为91.2%～103.6%。应用新建立的方法测定了7个不同产地忍冬藤和叶中8种活性成分的含量。该方法简单、快速、准确,可用于忍冬藤和叶的质量控制。

HPLC同时分析金银花中绿原酸和黄酮类成分的方法建立及其应用

目的建立应用反相高效液相色谱法同时测定金银花中绿原酸和4种黄酮类成分——芦丁、木犀草素7-O-β-D-半乳糖苷、忍冬苷、槲皮素含量的方法。方法色谱柱为AglientZorbax80A(4.6mm×250mm,5μm);流动相为乙腈-0.5%磷酸,梯度洗脱;流速1.0mL·min-1,检测波长为355nm。结果绿原酸、芦丁、木犀草素7-O-β-D-半乳糖苷、忍冬苷、槲皮素的线性范围分别为0.275-22μg(r=0.9998),7.725-772.5ng(r=0.9997),8.025-802.5ng(r=0.9999),7.725-772.5ng(r=0.9999),3.338-333.8ng(r=0.9999),平均回收率(n=9)分别为99.42%,99.11%,101.46%,98.61%,100.65%。结论本法准确、快速、重现性好,适合于同时测定各种金银花中绿原酸和黄酮类成分的含量。

山楂叶中多元酚类成分抗超氧阴离子活性研究及构效关系分析

目的研究山楂叶中多元酚类成分对超氧阴离子(O2(?))的清除能力,探讨其抗氧化活性与结构的关系。方法分别对德国单子山楂(Crataegus monogyna Jaeq.)叶和中国山楂(Crataegus pinnatifida Bge.var.major N.E.Br.)叶中多元酚类成分进行分离;通过化学发光法测定这些成分对邻苯三酚-鲁米诺-碳酸缓冲液(pH 10.2)体系产生的O2(?)的清除能力。结果从2种山楂叶中共分离得到12个多元酚类化合物,经鉴定分别为牡荆素(vitexin,Ⅰ)、2″-O-鼠李糖牡荆素(2″-O-rhamnosylvitexin,Ⅱ)、芦丁(rutin,Ⅲ)、金丝桃苷(hyperoside,Ⅳ)、3-O-β-D-葡萄糖槲皮素(3-O-β-D-glucosylquercetin,Ⅴ)、4″-O-乙酰基-鼠李糖牡荆素(4(?)- O-acetyl-2″-O-rhamnosylvitexin,Ⅵ)、槲皮素(quercetin,Ⅶ)、4″-O-葡萄糖牡荆素(4″-O-glucosylvitexin,Ⅷ)、4(?)-O-鼠李糖芦丁(4(?)- O-rhamnosylrutin,Ⅸ)、6″-乙酰牡荆素(6″-O-acetyl-vitexin,Ⅹ)、绿原酸(chlomgenic acid,Ⅺ)和咖啡酸(caffeic acid,Ⅻ)。抗氧化实验结果表明,12种多元酚类成分中Ⅰ,Ⅱ,Ⅵ,Ⅷ,Ⅹ清除超氧阴离子(O2(?))活性与维生素C相当,其他成分均比维生素C强。所有成分在一定范围内(清除率在10%～90%之间),量效呈对数关系(y=alogx+b)。构效关系分析显示,其清除超氧阴离子(O2(?))的活性取决于分子结构,具有明显的结构依赖性。结论山楂叶中多元酚类成分具有明显的清除超氧阴离子活性,是山楂叶抗氧化作用的主要活性成分。

玄参中4种主要活性成分的HPLC定量分析

目的建立应用HPLC—uV同时测定玄参中4种主要活性成分——哈巴俄苷、肉桂酸、安格洛苷C和acteoside含量的方法。方法采用Hypersil BDS—C18色谱柱（4、0mm×250mm，5μm），流动相为乙腈和1％醋酸水溶液，梯度洗脱，流速1mL·min^-1，检测波长278nm，柱温25℃。结果哈巴俄苷、肉桂酸、安格洛苷C和acteoside线性范围分别为15、12—302、4mg·L^-1，7、72—154．4mg·L^-1，24、84～496、8mg·L^-1，6．64—132．8mg·L^-1；平均回收率（n=5）分别为101、59％（RSD=2、40％），96．75％（1．32％），100．11％（3．95％），99、89％（2、08％）。结论本方法简单、快速、准确可靠，可作为玄参药材的质量控制方法。

蒲圻贝母中核苷类化学成分研究

目的对蒲圻贝母（Fritillaria puqiensisG.D.Yu et.G.Y.Chen）进行化学成分研究。方法采用各种色谱技术进行分离纯化,通过化合物理化性质及波谱数据进行结构鉴定。结果从正丁醇部位分离得到3个核苷类化合物和3个碱基,分别鉴定为2′-O-甲基腺嘌呤核糖核苷（Ⅰ）,尿嘧啶核糖核苷（Ⅱ）,腺嘌呤核糖核苷（Ⅲ）,尿嘧啶（Ⅳ）,胸腺嘧啶（Ⅴ）,腺嘌呤（Ⅵ）。结论首次对蒲圻贝母的核苷类成分进行了报道,化合物Ⅰ,Ⅱ,Ⅳ～Ⅵ系首次从贝母属植物中分离得到;其中化合物Ⅰ为稀有甲基修饰核苷,其13C-NMR数据为首次报道,并首次对其碳氢信号进行了全归属。

金银花中酚酸类和黄酮类成分的黄嘌呤氧化酶抑制活性

建立基于紫外分光光度原理的微孔板筛选方法,用于金银花药材中黄嘌呤氧化酶抑制剂的筛选,并进行抑制活性测定。通过对筛选条件优化,建立了可靠的筛选模型,并对从金银花中分离得到的20个单体化合物进行了筛选,发现8个酚酸类成分和4个黄酮类成分具有黄嘌呤氧化酶抑制活性,其中3,4-二咖啡酰奎宁酸甲酯、槲皮素和木犀草素有很好的活性,其IC50分别为8.36,6.46和2.08μmol/L。筛选结果表明,金银花中黄酮苷元的活性优于黄酮苷,双咖啡酰奎宁酸的活性明显优于单咖啡酰奎宁酸类成分,双咖啡酰奎宁酸甲酯的活性明显优于双咖啡酰奎宁酸,且双咖啡酰奎宁酸的5位取代对化合物的活性贡献最大。

体外细胞模型和高效液相质谱联用分析预测黄芪中的活性成分

利用体外细胞模型模拟体内细胞对中药有效成分的特异性吸收,结合高效液相色谱/质谱分析筛选中药黄芪中的生物活性成分。将中药黄芪提取液与Caco-2细胞及红细胞分别混合培养,破碎与药材结合后的细胞,使之释放出结合的药材中的成分。运用高效液相色谱/飞行时间质谱(HPLC-ESI/TOFMS)分析中药黄芪提取液与活性细胞有结合的成分,并对其进行结构鉴定。结果显示:黄芪中有10个化合物与Caco-2细胞结合,14个化合物与红细胞结合。本方法可用于预测口服药物在体内的吸收以及与特定靶细胞的结合情况,特异性地筛选中药复杂体系中的药效物质基础。

红腺忍冬藤茎中环烯醚萜苷类化合物的研究

目的研究红腺忍冬(Lonicera hypoglauca Miq．)藤茎的化学成分。方法利用硅胶柱色谱、制备高效液相色谱等方法进行分离,根据化合物的光谱数据和理化性质鉴定其结构。结果从红腺忍冬正丁醇萃取物中分离得到5个环烯醚萜苷类化合物,分别鉴定为马钱子苷(Ⅰ),獐牙菜苷(Ⅱ),secoxyloganin(Ⅲ),vogeloside(Ⅳ),secologanin(Ⅴ)。结论化合物Ⅰ～Ⅴ均为首次从该种中分离得到。

内皮细胞提取和高效液相色谱－电喷雾飞行时间质谱联用预测玄参中的活性成分

目的:应用内皮细胞提取和高效液相色谱-电喷雾飞行时间质谱联用(HPLC-ESI/TOF MS)预测玄参的活性成分。方法:应用内皮细胞作为靶细胞,中药提取液中的活性成分可选择性地与其结合,洗去未结合的成分,用HPLC-ESI/TOF MS对细胞解离液中的成分进行分析。结果:从玄参提取液中检测出6个可与内皮细胞结合的成分,其中3个鉴定为安格洛苷C(angoroside C)、肉桂酸(cinnamic acid)和哈巴俄苷(harpagoside)。结论:细胞解离液中检测到的成分为玄参中与内皮细胞有结合作用的成分,本方法可用于预测中药中与内皮细胞相结合的活性成分。

靶细胞提取和高效液相飞行时间质谱联用分析预测丹参中的活性成分

建立靶细胞提取和与高效液相飞行时间质谱联用(HPLC-ESI/TOFMS)分析相结合进行丹参活性成分研究的方法,对丹参中可能的活性成分进行了推测。将靶细胞和丹参样品一起孵育培养,根据活性成分可以与靶细胞膜有特异性的结合或者进入靶细胞内的原理,用HPLC-MS方法对培养后细胞破碎液中的成分进行分析。从加药Raw264.7细胞和Ecv304细胞破碎液中检测到丹参素、原儿茶醛、咖啡酸、丹酚酸D、紫草酸、迷迭香酸及丹酚酸B7种丹参中成分,在加药的HL7702细胞破碎液中检测出丹参素、原儿茶醛、咖啡酸及丹酚酸B4种丹参中的水溶性成分。结果显示:细胞破碎液中检测的成分为丹参在靶细胞中有吸收的成分,本方法可用于预测中药中的活性成分。

丹参成分在Caco-2细胞中吸收的研究

目的建立改良的Caco-2细胞模型研究丹参中的可吸收成分,并用在体动物模型验证。方法HPLC-MS方法测定加入丹参水提取物的Caco-2细胞破碎液中的丹参成分,并与大鼠在体灌流给药后血浆中的成分相比较。结果加药Caco-2细胞破碎液中检测到丹参素、原儿茶醛、咖啡酸、丹酚酸D、紫草酸、迷迭香酸、丹酚酸B7种丹参的成分,给药后大鼠血浆中检测到丹参素、原儿茶醛、咖啡酸、丹酚酸D、紫草酸、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A共8种丹参的成分。结论细胞破碎液中检测的成分为丹参在Caco-2细胞中有吸收的成分,本方法可作为研究中药吸收的新方法。

角蒿中的环己乙醇类化学成分研究

利用Sephadex LH-20及硅胶等柱色谱技术从药用民族植物角蒿(Incarvillea dissectifoliolaQ.S.Zhao)的根茎中分离得到了11个环己乙醇类化合物。经理化数据对照和波谱分析,确定它们的结构分别为rengyolone(1),(3aS,6R)-2,3,3a,6,7,7a-hexahydrobenzofuran-3a,6-diol(2),(3aR)-hexahydro-3a-hydroxybenzofuran-6(2H)-one(3),(3aR,6R)-octahydrobenzofuran-3a,6-diol(4),(3aR,6S)-octahydrobenzofuran-3a,6-diol(5),4-hydroxy-4-(2-hydroxyethyl)cyclohexanone(6),(3aS,4S)-hexahydro-3a,4-dihydroxybenzofuran-6(2H)-one(7),(3aR,4S)-hexa-hydro-3a,4-dihydroxy benzofuran-6(2H)-one(8),rengyol(9),isorengyol(10)和rengyoside B(11)。这11个化合物均为首次从角蒿中分离得到。化合物4,5,6,7,8,9,10的细胞毒活性未见报道,对它们的细胞毒活性进行了测定,结果表明它们对HL-60细胞株的IC50分别为102,44.7,24.6,98.0,47.8,25.3,92.3和47.2μmol/L。