基于液相PNA-FISH技术的单增李斯特菌检测方法研究

为了提高单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes)的检测效率和检测通量,本研究在前期初步建立的液相肽核酸荧光原位杂交(PNA-FISH)检测方法基础上,分别采用50%酒精加4%多聚甲醛和80%酒精加PBS两种杂交前处理方式进行细菌固定试验。结果显示,两种方法在95%的置信区间内无显著性差异,PBS可代替多聚甲醛使用。本研究进一步利用特异性探针Lm-16S-2初步建立单增李斯特菌液相PNA-FISH方法,特异性试验结果显示,该方法与17株常见单增李斯特菌杂交的荧光值明显高于阴性对照,而8株非单增李斯特菌和14株非李斯特菌杂交的荧光值与阴性对照无差别,表明该方法特异性强;将单增李斯特菌菌液10倍倍比稀释(101 cfu/mL^108 cfu/mL)后同时利用该方法及传统细菌生化鉴定法检测,进行敏感性试验。结果显示,该方法与传统细菌生化鉴定法敏感性相同,对单增李斯特菌的检测限均为104 cfu/mL,敏感性较高。对8个批次不同种单增李斯特菌进行重复性试验,结果显示批内和批间荧光值变异系数均小于5%,重复性好;经更换不同实验室及操作人员后检测同一批次不同浓度的单增李斯特菌,结果显示试验结果可以重复再现,稳定性好。对28份家禽组织样品经国标法增菌培养后采用液相PNA-FISH方法检测,结果显示该方法与传统细菌生化鉴定法检测单增李斯特菌的符合率达到100%,并大大缩减检测时间。本研究建立的单增李斯特菌液相PNA-FISH方法能够高效、快速、准确的检测单增李斯特菌,为该菌的检测提供了一种可行技术手段。

肽核酸荧光原位杂交技术检测生肉中沙门氏菌方法的建立及应用

本研究设计了一种基于沙门氏菌毒力基因侵袭蛋白A(invA)的特异性肽核酸(PNA)探针,在前期优化条件的基础上,建立并评估了沙门氏菌肽核酸荧光原位杂交(PNA-FISH)的检测方法。特异性试验结果显示,该方法的Sal-invA探针除对目标菌杂交呈阳性外,与12株常见的非目标菌杂交均为阴性,特异性强;灵敏度试验结果显示,该方法对沙门氏菌的检测限为105 cfu/mL,而荧光定量PCR方法和细菌分离培养法对沙门氏菌的最低检测限分别为102 cfu/mL和105 cfu/mL,PNA-FISH方法的灵敏度与分离培养方法相近。人工污染沙门氏菌的生肉制品,增菌培养后经上述3种方法检测的最低检测限均可达到100 cfu/mL。对83份生鲜肉经增菌培养后,用上述3种方法检测。结果显示,该方法与细菌分离培养方法和荧光定量PCR方法的符合率均达到98.8%。表明,增菌培养是提高该PNA-FISH检测方法灵敏性的重要步骤。本研究建立的检测沙门氏菌的PNA-FISH方法快速、准确、灵敏,适合用于临床肉制品的检测。

肽核酸在微生物检测中的应用

核酸是由许多核苷酸单体聚合成的生物大分子化合物,为生命的最基本物质之一,在遗传信息传递中发挥着重要的作用,核酸序列分析对阐释生命活动具有重要意义。寡核苷酸探针可用于微生物等的核酸序列检测和分析,但应用寡核苷酸探针检测核酸序列时存在一些不足与缺陷,如其抵御核酸酶降解的能力较弱、杂交分子的解链温度低.

一种灰茶尺蠖高效引诱剂的研制及其田间防效评价

为研制有效诱杀重要害虫灰茶尺蠖雌、雄成虫的性信息素/植物源信息物复合型性诱剂,选源自茶梢和茶花挥发物的30个主要成分,分别配成10^(-6)g/mL、10^(-4)g/mL和10^(-2)g/mL液体石蜡溶液作味源,检测其引起1日龄灰茶尺蠖雌、雄成虫的EAG反应值。结果表明:(1)每种味源的3个剂量处理皆引起明显的EAG反应;随着味源浓度增加,EAG反应值显著增大;(2)引起的雌、雄成虫EAG反应值相近,差异不显著;(3)芳樟醇、反-2-己烯醛、顺-3-己烯-1-醇、己醇、苯乙醇和6-甲基-5-庚烯-2-酮的每个剂量处理引起强烈的EAG反应。将这6种EAG活性成分与灰茶尺蠖2个主要的性信息素成分Z,Z,Z-3,6,9-十八碳三烯和Z,Z-3,9-6,7-环氧-十八碳二烯配成数个备选的复合型性诱剂,载于羊毛毡细条上、塑封、制成诱芯,在茶园中检测其引诱活性,发现诱效最优的复合型性诱剂在每个诱芯上组成为:6种EAG活性成分各2 mg、Z,Z,Z-3,6,9-十八碳三烯0.4 mg、Z,Z-3,9-6,7-环氧-十八碳二烯0.6 mg、抗氧化剂——2,6-二叔丁基-4-甲基苯酚1 mg、正己烷100μL。此外,使用土黄、荧光黄、米黄、素馨黄、桔黄、土褐、墨绿、芽绿、草绿、荧光绿、天蓝、大红和纯白等13种色板诱杀灰茶尺蠖成虫,发现其偏嗜暗黄色,以土黄色效果最佳。遂将该诱芯载于土黄色粘板上组成诱捕器,诱杀防治灰茶尺蠖主害代——第3代,试验程序:在第2代羽化始盛期用诱捕器诱杀成虫以减少交尾几率而压低第3代幼虫数,在第3代初龄幼虫期喷施2.5%联苯菊酯、茶尺蠖核型多角体病毒·苏云金杆菌悬浮剂(1×10^(4)PIB·2000 IU/μL),接着定期调查三者的防治效果,结果表明复合型性诱剂的防效显著优于后两者。该研究为灰茶尺蠖的绿色防控提供了可敷应用的技术产品。

花期杭白菊植株引诱菊小长管蚜的嗅觉和视觉线索及应用

杭白菊是一类顶级的茶用菊,原产地是浙江省桐乡市。菊小长管蚜Macrosiphoniella sanborni是菊属植物重要害虫,常常在花期觅食于花上和匿于花内,随着菊花采摘、加工而残留在菊花产品中。冲饮菊花茶过程中,蚜尸或肢体就浮现在菊花茶汤中,致饮者“倒胃口”。为揭示该蚜嗜好花朵原因和研制有效的防控手段以便在花期控制该蚜,分离鉴定了花期杭白菊植株的36种挥发性化合物,挑选其中含量大的、主要的17种用作味源,对该蚜做行为测定。发现a-蒎烯、反-2-己烯醛、(+)-4-蒈烯、顺-3-己烯乙酯、顺式-β-罗勒烯、γ-萜品烯、或者1-辛烯-3-乙酯7种成分的10-4g/mL的正己烷溶液显著地吸引该蚜雌、雄成蚜。依次将该7种成分的每种10-2g/mL正己烷溶液与蚜虫性信息素荆芥内酯的10-4g/mL正己烷溶液按照60∶10∶10∶2∶2∶20∶2∶1体积比配制成复合型蚜虫引诱剂,在菊园中与专利产品蚜虫引诱剂比较诱效,结果表明前者对于该蚜更具有引诱力。此外,在杭白菊园进行的该蚜趋色行为测定中,测得菊花黄对该蚜诱效稍强于芽绿色。随后,将每块菊花黄粘板附1个复合型蚜虫引诱剂诱芯,组成1个诱捕器,在杭白菊花期的菊园放置相互间距7 m×8 m的诱捕器诱杀成蚜。结果证实:不仅每个诱捕器诱杀了大量菊小长管蚜成虫,而且诱捕器的防效优于吡虫啉药液。认为:花期杭白菊植株的主要挥发性化合物和花朵上雌蚜释放的性信息素(嗅觉线索)与菊花的黄色(视觉线索)叠加引诱了菊小长管蚜;研制的载有复合型蚜虫引诱剂的菊花黄粘板可用作花期有效诱杀菊小长管蚜的手段。

冬季遮阳网茶园昆虫趋色性及其群落结构分析

茶园建设固定遮阳网可助力干旱时节抗旱和冬季防冻,但茶园病虫害也常发。目前,有关固定遮阳网茶园昆虫群落缺乏研究。以浙江松阳县建有的固定遮阳网茶园为对象,冬季采用13种颜色的诱虫色板每隔10 d依次对5块遮阳网茶园内昆虫进行诱捕,统计24 h内捕获的种数和个体数。结果共捕获6个目37个科的2940个昆虫(蜘蛛);诱捕量最多的为双翅目,种数、个体数分别占总物种数、总个体数的29.7%和69.5%;聚类分析将13种色板中的荧光绿、芽绿、米黄、土黄、橘黄、草绿、荧光黄和素馨黄色板聚为一类,每种色彩的每块板平均诱捕的物种数和个体数分别是(19.4±2.4)种和(286.9±55.4)个;墨绿、大红、天蓝、土褐和纯白5种色板聚为一类,每种色彩的每块板平均诱捕的物种数和个体数分别是(11.8±3.3)种和(129.0±36.4)个;主要害虫有茶小绿叶蝉、茶蚜和黑刺粉虱等,主要天敌是尺蠖原绒茧蜂和单白绵副绒茧蜂。研究认为遮阳网茶园成为主要害虫和重要天敌的越冬庇护场所;芽绿、素馨黄、荧光绿和荧光黄等色板可作为监测茶园虫情的手段之一。

茭白品种间基因组ISSR多态性分析

对浙江、湖北、江苏等省3个野生茭白材料17个不同品种的茭白种质资源进行了收集,利用ISSR方法对茭白植株进行了基因组多态性分析.结果表明,野生茭白与栽培茭白品种间具有明显的多态性,不同来源的栽培茭白品种间也具有一定的多态性,多态性比例分布在12%-25%之间.利用DPS软件对茭白植株的多态性位点进行的系统聚类分析发现,野生茭白与栽培茭白间距离较远,茭白地域分布及栽培特性与种质资源多样性相关。

类酵母共生菌中两个组氨酸合成基因在褐飞虱发育中的作用

褐飞虱[Nilaparvata lugens（Stl）]是我国水稻上的主要害虫,专一性吸食必需氨基酸缺乏的水稻筛管液。利用基因组和转录组数据,人们构建了褐飞虱及其体内类酵母共生菌（YLS）参与组氨酸等必需氨基酸的合成途径。在此基础上,本研究旨在通过基因克隆和RNA干扰研究YLS的His2和His6（分别命名为EdeHis2和EdeHis6）在褐飞虱生长、发育和存活中的作用。同源搜索和系统发育分析表明EdeHis2和EdeHis6均源于YLS基因组,与绿僵菌His2和His6高度同源并在系统发育树中形成一个簇,但在褐飞虱基因组中无同源基因。基因的时空表达分析表明,His2和His6在褐飞虱的各个龄期均表达且呈现一定的波动性,在褐飞虱脂肪体中的表达量均显著高于头、足、体壁和中肠。此外,在褐飞虱头和翅的基因组中未能扩增到目的片段,而在腹部能扩增出目的片段。分别注射外源双链RNA（dsEdeHis2或dsEdeHis6）后的第2、4、6天,EdeHis2的表达量分别显著下调45%~60%,EdeHis6下调27%~55%。dsEdeHis2和dsEdeHis6分别使褐飞虱的死亡率提高了8.3%和9.2%,雌、雄虫的若虫期历期延长了0.43d、0.33d和0.65d、0.36d,但均未达到显著水平。另外,注射dsEdeHis6的褐飞虱雌雄成虫翅畸形率分别为11%和13%,显著高于对照组。综上所述,源于YLS的EdeHis2和EdeHis6参与褐飞虱组氨酸的合成,与褐飞虱的存活、发育和翅发育相关。

灰茶尺蠖为害诱导茶树释放的互利素的鉴定

为鉴定灰茶尺蠖为害诱导茶树释放的互利素,遂以SDE法提取灰茶尺蠖为害茶梢和正常茶梢挥发物,经GC-MS检测,分别鉴定出31和25种组分,二者总含量相对于等剂量内标的含量分别是1863.8%和1124.6%。与正常茶梢相比,灰茶尺蠖为害茶梢挥发物中苯甲醛、反-2-癸烯醛、吲哚、水杨酸、反-2-己烯醛和己醛含量显著增加。将灰茶尺蠖为害茶梢挥发物的18种主要组分分别溶于液体石蜡制成10^-4 g/m L味源,以Y形嗅觉仪检测茶尺蠖绒茧峰对味源的趋性;与液体石蜡相比,苯甲醛、水杨酸、反-2-己烯醛和己醛诱效显著,反-2癸烯醛、4-庚烯醛和吲哚的诱效明显,其他11组分无明显诱效。再将前7种组分配成10^-2g/mL引诱剂,分别载于橡皮头制成诱芯,附于芽绿粘板上,在茶园茶尺蠖绒茧蜂盛发期实施诱捕,携带前4种诱芯的芽绿粘板诱捕的蜂数明显多于后3种、且显著多于无诱芯的芽绿粘板,而且携带10^-2 g/mL苯甲醛、水杨酸和反-2-己烯醛等量混合物诱芯的诱效最强。认为苯甲醛、水杨酸、反-2-己烯醛和己醛是灰茶尺蠖取食诱导的茶树互利素。

昆虫共生菌的垂直传播

共生菌普遍存在于昆虫体内,它们能够为宿主昆虫提供生长发育所必需的氨基酸、固醇类等营养物质,还能提高昆虫适应高温、寄生虫、病毒等不利环境因素的能力,昆虫则为共生菌提供稳定的生存环境和营养物质,昆虫与共生菌相互依存。多数情况下,共生菌通过垂直传播在宿主代次间进行传播,即共生菌由母代传递给子代。结合最近几年相关研究,本文综述了不同昆虫共生菌的垂直传播模式。除极少数肠道共生菌通过污染卵壳被宿主幼虫取食得以垂直传播外,垂直传播的共生菌多为经卵传播。根据侵染时期的不同,共生菌经卵传播模式多数可分为以下4种:侵染宿主昆虫幼虫中的生殖干细胞、侵染宿主昆虫年轻雌成虫中的生殖干细胞、侵染宿主昆虫雌成虫中的成熟卵母细胞以及侵染宿主昆虫囊胚期胚胎。其中,有些共生菌是以共生菌菌胞整体侵染的方式进入到宿主卵巢。另外,少数肠道共生菌也通过卵巢进行垂直传播,此类共生菌先侵染卵巢侧输卵管并在侧输卵管聚集,待卵排放至侧输卵管时再进入到卵中。在文中,我们也探讨了昆虫共生菌垂直传播过程中的细胞机制和免疫机制,包括共生菌避开宿主免疫反应、共生菌通过内吞作用进入卵巢以及不同共生菌间的协同作用等。

生姜新品种小林黄姜1号的选育

小林黄姜1号是由浙江临平特色小黄姜品种小林红爪姜经系统选育获得的生姜新品种。植株生长势强,株高约90 cm,分枝能力强,单株分蘖数10~15个;姜块肥厚呈块状,长约28 cm,宽约15 cm,姜球数多,排列紧密,皮、肉皆为黄色,肉质细嫩,辛香味浓,姜辣素含量16.45 g·kg^(-1),挥发油含量0.70%,粗纤维含量1.2%;播种至采收209 d(天)左右,单株根茎质量约1.2 kg,以孙姜及玄曾姜为主,每667 m^(2)产量2200 kg左右;高抗姜瘟病,中抗姜白星病,适合浙江地区种植。

含五种RNA病毒核酸假病毒的制备及特性研究

目的:制备一种应用于细胞制剂中丙型肝炎病毒(HCV)、人类免疫缺陷病毒1型和2型(HIV-1/2)、人类T细胞白血病病毒1型和2型(HTLV-1/2)五种RNA病毒核酸检测的阳性质控品,即装载上述五种病毒核酸的假病毒5V(5V)。方法:将上述病毒的部分基因片段连接成一条基因,与MS2噬菌体部分基因共同插入原核表达载体中构建pACYCDuet-1-MS2/5Virus重组质粒,转化到E.coli BL21(DE3)感受态中表达并鉴定;表达产物纯化浓缩,电镜分析5V形态;对5V进行DNase I、RNase A抗性及保存期的稳定性试验。结果:重组基因有效表达,5V纯度高无杂带;5V成功包装目的基因序列,具有明显的病毒结构特征;5V能抵抗高浓度的DNase I和RNase A的降解,在-20℃稳定保存6个月。结论:制备的5V稳定,达到了作为细胞制剂中RNA病毒核酸检测阳性质控品的基本要求。

菰黑粉菌遗传转化体系启动子的筛选

目的:构建菰黑粉菌(Ustilago esculenta P.Henn.)高效的遗传转化体系。方法:基于菰黑粉菌RNA-seq结果,筛选出10个高强度启动子,以pUMa932为基础载体,将异源启动子P_(otef)使用DNA无缝克隆技术替换成所筛选的启动子构建相关载体,以菰黑粉菌UeT55为实验材料,基于PEG介导原生质体转化构建表达菌株。通过qRT-PCR测定不同启动子下eGFP的表达量,并用Image J软件分析测定转化子的荧光强度。结果:启动子P_(mdh1)、P_(mix17)、P_(eno)、P_(qcr8)驱动的eGFP基因表达量和荧光强度与对照P_(otef)无显著差异,启动子P_(mia40)、P_(sti1)、P_(odc2)驱动的eGFP基因表达量和荧光强度均显著低于对照,而启动子P_(hsp)、P_(ef)、P_(cox12)驱动的eGFP基因表达量分别比P_(otef)驱动的高9倍、5倍、2倍以上,荧光强度分别高6倍、4倍、1.5倍以上,均显著高于对照。结论:P_(hsp)启动子表达能力最强,且表达稳定,适宜作为强启动子用于菰黑粉菌遗传转化体系构建。

茭白叶斑病病原高粱附球菌的鉴定及防治药剂筛选

0 引言茭白(Zizania latifolia)为禾本科菰属多年生宿根草本植物[1],距今已有近千年的栽培历史。由于茭白营养丰富,深受消费者喜爱,逐渐成为我国除莲藕外的第二大水生类蔬菜。其较高的经济价值,亦成为我国农村经济收入的重要来源[2]。随着市场需求量增大,茭白的种植面积也逐渐扩大,连片的机械化作业导致茭白的病害面积扩散,使得茭白的病害日趋严重与多样化,严重影响了茭白的产量与质量,阻碍了茭白产业的发展扩大。

不同茭白品种中菰黑粉菌的鉴定及ISSR多态性分析

菰黑粉菌是茭白的内生真菌,对茭白孕茭具有重要作用。本文分离获得了13个不同茭白品种和孕茭表型的菰黑粉菌菌株(M‐T型和T型),ITS序列鉴定分析发现:13个菌株都属于菰黑粉菌,它们的ITS序列仅在ITS1序列区间存在3个碱基位点的变异;基于ISSR技术比较分析了菰黑粉菌菌株间的遗传多态性,聚类分析表明,菰黑粉菌菌株的遗传多态性与茭白栽培特点及孕茭表型密切相关,本研究有助于茭白种质资源的鉴定及保护,并为茭白田间栽培管理提供了技术支持和理论依据。

UeFuz7在菰黑粉菌二型态转换中的作用

菰黑粉菌与茭白植株互作形成膨大肉质茎——茭白,已成为我国第二大水生蔬菜。作为一种二态性真菌,菰黑粉菌的二型态转换与侵染茭白密切相关,对茭白孕茭至关重要。本研究基于菰黑粉菌全基因组序列,采用t Blastn进行同源基因查找,克隆得到了玉米瘤黑粉菌Fuz7的同源基因UeFuz7。该基因c DNA全长1 308 bp,无内含子,编码435个氨基酸,在黑粉菌中相对保守。酵母双杂交实验发现,UeFuz7可与UeKpp2蛋白互作。同时其表达模式分析发现,在菰黑粉菌的二型态转换发生时UeFuz7的相对表达量最高。进一步通过PEG介导的原生质体转化获得UeFuz7突变体,表型分析发现:在二型态转换过程中,UeFuz7突变菌株的接合管形成和菌丝生长能力明显减弱。以上结果表明UeFuz7作用于菰黑粉菌的二型态转换。

UeRbf1调控菰黑粉菌丝状生长和致病力的作用研究

基于菰黑粉菌的全基因组序列,克隆得到了UeRbf1(GenBank登录号:MW375682),该基因的开放阅读框为1 281 bp,无内含子,编码426个氨基酸,经预测具有3个C_(2)H_(2)锌指结构域,提示其具有转录调控功能。进一步在菰黑粉菌中敲除UeRbf1后进行体外生长及侵染试验,发现:在体外培养时,UeRbf1的缺失没有改变菌株的生长速率及单倍体形态,也未改变两个性亲和UeRbf1缺失突变体的融合及菌丝形成能力,但是融合菌丝的丝状生长能力显著减弱,而且在侵染时UeRbf1缺失突变体丧失了菌丝形成及丝状生长能力,人工接种野茭后也无法使其茎部膨大。以上结果表明,UeRbf1是调控菰黑粉菌丝状生长和侵染能力的一个重要因子。另外,UeRbf1缺失突变后,在体外融合及侵染时相关丝状生长和致病力的调控因子Biz1、Clp1、Hdp1和UeKpp6呈下调表达,其中Biz1的下调表达最为显著,在突变体中几乎不表达,说明UeRbf1对菰黑粉菌丝状生长和致病力的影响,可能是通过调控Biz1来实现的。

菰黑粉菌T-DNA突变体库的构建及分析

通过建立适用于菰黑粉菌Ustilago esculenta的农杆菌介导遗传转化(Agrobacterium tumefaciens-mediated transformation,ATMT)体系,构建菰黑粉菌T-DNA插入突变体库。针对性地筛选双核菌丝形成缺陷型转化子,并对T-DNA插入位点进行分析,为研究菰黑粉菌二态型转换的分子调控机理打下基础。以构建的菰黑粉菌自融合菌株TSP为出发菌株,以含有遗传霉素(G418)抗性基因(neo)的质粒为载体,通过ATMT构建菰黑粉菌T-DNA突变体库,并对诱导剂乙酰丁香酮(AS)浓度、转化的共培养时间、农杆菌浓度和菰黑粉菌芽孢子浓度等建库影响因素进行单因素条件试验,筛选最优条件;对继代培养的转化子基因组中的遗传霉素抗性基因进行PCR检测,验证转化子遗传稳定性;对突变体库中的转化子双核菌丝生长情况进行观察,测定其双核菌丝形成能力;对上述双核菌丝形成缺陷型转化子进行基因组重测序,分析其T-DNA插入位点。当遗传霉素浓度为75μg/mL时,菰黑粉菌的生长被完全抑制。当AS浓度为100μg/mL、共培养时间为24 h、孢子浓度为1×10^(5)个/mL、农杆菌浓度为OD600=0.3时,转化获得转化子的效率最高,为菰黑粉菌ATMT最优转化体系。在突变体库中随机选取7株转化子在YEPS固体平板上继代培养10代,仍然能够通过PCR的方法在基因组中检测到neo基因片段,说明T-DNA成功插入TSP菌株基因组且稳定遗传。针对部分转化子进行双核菌丝生长能力测定,有5株转化子的菌落边缘没有形成菌丝,而TSP菌株的边缘长出了明显的菌丝,说明这5株转化子双核菌丝形成的能力丧失。对上述双核菌丝形成缺陷型转化子中的其中2个(TSP-1、TSP-23)进行基因组重测序,比对结果显示,TSP-1插入位点位于其交配型基因a位点的(GenBank:MK097140.1)mfa2.1基因的外显子区域,TSP-23插入位点位于两个假定蛋白之间。本研究优化了菰黑粉菌ATMT遗传转化体系,构建了菰黑粉菌T-DNA插入突变体库;筛选到双核菌丝生长缺陷型突变体,并通过基因组重测序的手段明确了相关突变体的T-DNA插入位点,为后续菰黑粉菌二型态转换的调控机理研究奠定了一定的基础。

基于TaqMan探针实时荧光PCR的菰黑粉菌分型检测方法

菰黑粉菌(Ustilago esculenta)是一种专性寄生植物茭白(Zizania latifolia)的活体营养型真菌,菌丝态菰黑粉菌(MT型)侵染茭白后可以使植株茎部膨大形成可食用肉质茎,即茭白。田间种植中还存在冬孢子态菰黑粉菌(T型),其侵染形成的膨大肉质茎内布满黑色冬孢子,无法食用,称作灰茭。为及早发现并去除灰茭植株,本研究对比了T型与MT型菰黑粉菌内转录间隔区序列(ITS),利用ITS上的单核苷酸多态性位点设计TaqMan探针与引物。本研究筛选得到了具有良好特异性的TaqMan探针及引物,优化了反应体系中的引物浓度与探针浓度,建立并优化了菰黑粉菌分型鉴定方法。该方法不受植物基因组DNA等基质影响,且菰黑粉菌基因组浓度在0.5~2000 ng·L^(-1)范围内时,结果具有良好的线性关系,判定系数(R^(2))>0.99。通过该方法对植物中T型和MT型菰黑粉菌分型定量,可以在茭白种植早期发现将结灰茭的植株,为灰茭预防及栽培措施改良提供新的参考。