皱纹沙丘蜗牛的鉴定与检疫管理

通过贝壳形态和分子生物学方法对江阴海关从进境法国大麦中截获的蜗牛标本进行鉴定,确认为皱纹沙丘蜗牛(Candidula intersecta(Poiret,1801)),属国内首次截获。该蜗牛在原产地主要危害谷物类、苹果、梨、李子等的果实和幼苗,造成重大经济损失,也是新西兰、澳大利亚和美国等入侵地危害严重的外来有害生物。本种在国内尚无分布,本文报道该蜗牛的鉴定结果,并对其地理分布、生物学、危害性及发生规律等做了概述,提出了相应的检疫管理措施。

褐飞虱吞蛋白的基因克隆、多克隆抗体制备及表达定位

【目的】探析吞蛋白(endophilin)在褐飞虱Nilaparvata lugens生长繁殖过程中的作用。【方法】克隆褐飞虱吞蛋白基因,并进行生物信息学分析;在大肠杆菌Escherichia coli Rosetta中诱导表达褐飞虱吞蛋白基因,融合蛋白经Ni柱亲和层析法纯化后,免疫新西兰兔子,获得相应的多克隆抗体;将所得的抗体用于检测褐飞虱卵巢中吞蛋白的表达和定位。【结果】克隆得到褐飞虱两个吞蛋白基因endophilin A(Endo A)和endophilin B(Endo B),GenBank登录号分别为KY126096和KY126095,分别编码387个和352个氨基酸,都含有吞蛋白典型的BAR结构域和SH3结构域,但它们在结构上存在差异。ELISA和Western blot检测结果表明,制备的兔抗血清效价达1∶1 000 000,并表现出较好特异性。将获得的抗体应用于免疫荧光实验表明,Endo A和Endo B蛋白在褐飞虱卵巢中普遍表达,在卵巢滤泡细胞的细胞间隙、细胞膜、细胞质中广泛分布,而且与脂类物质的分布模式类似,与正在侵入褐飞虱卵巢的类酵母共生菌共定位。【结论】获得了褐飞虱吞蛋白基因Endo A和Endo B序列,并明确了其生物信息学特征,成功制备了Endo A和Endo B多克隆抗体,分析了Endo A和Endo B在褐飞虱卵巢中的表达情况,认为其可能与褐飞虱卵巢发育和成熟以及类酵母共生菌入侵褐飞虱卵巢有关。这些结果为进一步研究Endo A和Endo B在褐飞虱中的生物学功能奠定了基础。

类酵母共生菌中两个组氨酸合成基因在褐飞虱发育中的作用

褐飞虱[Nilaparvata lugens（Stl）]是我国水稻上的主要害虫,专一性吸食必需氨基酸缺乏的水稻筛管液。利用基因组和转录组数据,人们构建了褐飞虱及其体内类酵母共生菌（YLS）参与组氨酸等必需氨基酸的合成途径。在此基础上,本研究旨在通过基因克隆和RNA干扰研究YLS的His2和His6（分别命名为EdeHis2和EdeHis6）在褐飞虱生长、发育和存活中的作用。同源搜索和系统发育分析表明EdeHis2和EdeHis6均源于YLS基因组,与绿僵菌His2和His6高度同源并在系统发育树中形成一个簇,但在褐飞虱基因组中无同源基因。基因的时空表达分析表明,His2和His6在褐飞虱的各个龄期均表达且呈现一定的波动性,在褐飞虱脂肪体中的表达量均显著高于头、足、体壁和中肠。此外,在褐飞虱头和翅的基因组中未能扩增到目的片段,而在腹部能扩增出目的片段。分别注射外源双链RNA（dsEdeHis2或dsEdeHis6）后的第2、4、6天,EdeHis2的表达量分别显著下调45%~60%,EdeHis6下调27%~55%。dsEdeHis2和dsEdeHis6分别使褐飞虱的死亡率提高了8.3%和9.2%,雌、雄虫的若虫期历期延长了0.43d、0.33d和0.65d、0.36d,但均未达到显著水平。另外,注射dsEdeHis6的褐飞虱雌雄成虫翅畸形率分别为11%和13%,显著高于对照组。综上所述,源于YLS的EdeHis2和EdeHis6参与褐飞虱组氨酸的合成,与褐飞虱的存活、发育和翅发育相关。

昆虫共生菌的垂直传播

共生菌普遍存在于昆虫体内,它们能够为宿主昆虫提供生长发育所必需的氨基酸、固醇类等营养物质,还能提高昆虫适应高温、寄生虫、病毒等不利环境因素的能力,昆虫则为共生菌提供稳定的生存环境和营养物质,昆虫与共生菌相互依存。多数情况下,共生菌通过垂直传播在宿主代次间进行传播,即共生菌由母代传递给子代。结合最近几年相关研究,本文综述了不同昆虫共生菌的垂直传播模式。除极少数肠道共生菌通过污染卵壳被宿主幼虫取食得以垂直传播外,垂直传播的共生菌多为经卵传播。根据侵染时期的不同,共生菌经卵传播模式多数可分为以下4种:侵染宿主昆虫幼虫中的生殖干细胞、侵染宿主昆虫年轻雌成虫中的生殖干细胞、侵染宿主昆虫雌成虫中的成熟卵母细胞以及侵染宿主昆虫囊胚期胚胎。其中,有些共生菌是以共生菌菌胞整体侵染的方式进入到宿主卵巢。另外,少数肠道共生菌也通过卵巢进行垂直传播,此类共生菌先侵染卵巢侧输卵管并在侧输卵管聚集,待卵排放至侧输卵管时再进入到卵中。在文中,我们也探讨了昆虫共生菌垂直传播过程中的细胞机制和免疫机制,包括共生菌避开宿主免疫反应、共生菌通过内吞作用进入卵巢以及不同共生菌间的协同作用等。

冬虫夏草大米培养基培养条件的正交试验筛选

冬虫夏草是一种被人们普遍接受的药用真菌。由于其生长缓慢,培养条件苛刻,故难以大规模人工培养应用。本文以实验室分离得到的虫草菌株Ophiocordyceps sinensis CCTCC M2016041为研究对象,通过正交试验设计对影响虫草菌株在大米培养基上生长的光照、温度和菌液接种量这3个因素进行9 d的观察,每3 d记录菌体的增重量,以确定大米培养基培育虫草的最佳生长条件,并测量其甘露醇含量。结果表明,3个影响因子光照、温度和菌液接种量的重要性在生长初期(前3 d)依次为光照>温度>菌液接种量;在生长中期(3~6 d)为温度>光照>菌液接种量;在生长后期(6~9 d)为光照>温度>菌液接种量。培养虫草菌的最适条件为光照24 h、培养温度25℃、1∶1(m L∶g)的菌米接种体积重量比。而米基培养的M2016041菌株菌丝中虫草酸含量为(8.42±0.45)mg/g。本试验能够为人工模拟自然条件下虫草的大规模培养提供一种有效的技术方法。

含五种RNA病毒核酸假病毒的制备及特性研究

目的:制备一种应用于细胞制剂中丙型肝炎病毒(HCV)、人类免疫缺陷病毒1型和2型(HIV-1/2)、人类T细胞白血病病毒1型和2型(HTLV-1/2)五种RNA病毒核酸检测的阳性质控品,即装载上述五种病毒核酸的假病毒5V(5V)。方法:将上述病毒的部分基因片段连接成一条基因,与MS2噬菌体部分基因共同插入原核表达载体中构建pACYCDuet-1-MS2/5Virus重组质粒,转化到E.coli BL21(DE3)感受态中表达并鉴定;表达产物纯化浓缩,电镜分析5V形态;对5V进行DNase I、RNase A抗性及保存期的稳定性试验。结果:重组基因有效表达,5V纯度高无杂带;5V成功包装目的基因序列,具有明显的病毒结构特征;5V能抵抗高浓度的DNase I和RNase A的降解,在-20℃稳定保存6个月。结论:制备的5V稳定,达到了作为细胞制剂中RNA病毒核酸检测阳性质控品的基本要求。

菰黑粉菌遗传转化体系启动子的筛选

目的:构建菰黑粉菌(Ustilago esculenta P.Henn.)高效的遗传转化体系。方法:基于菰黑粉菌RNA-seq结果,筛选出10个高强度启动子,以pUMa932为基础载体,将异源启动子P_(otef)使用DNA无缝克隆技术替换成所筛选的启动子构建相关载体,以菰黑粉菌UeT55为实验材料,基于PEG介导原生质体转化构建表达菌株。通过qRT-PCR测定不同启动子下eGFP的表达量,并用Image J软件分析测定转化子的荧光强度。结果:启动子P_(mdh1)、P_(mix17)、P_(eno)、P_(qcr8)驱动的eGFP基因表达量和荧光强度与对照P_(otef)无显著差异,启动子P_(mia40)、P_(sti1)、P_(odc2)驱动的eGFP基因表达量和荧光强度均显著低于对照,而启动子P_(hsp)、P_(ef)、P_(cox12)驱动的eGFP基因表达量分别比P_(otef)驱动的高9倍、5倍、2倍以上,荧光强度分别高6倍、4倍、1.5倍以上,均显著高于对照。结论:P_(hsp)启动子表达能力最强,且表达稳定,适宜作为强启动子用于菰黑粉菌遗传转化体系构建。

有翅桃蚜蚜群中新蚜虫疠霉和烟蚜茧蜂的互作关系初探

虫霉目真菌和蚜茧蜂是蚜虫的重要专性生防因子,在田间生态系统中存在"共位共处"的现象。本文开展了以新蚜虫疠霉和烟蚜茧蜂为代表的虫霉目真菌和蚜茧蜂在有翅蚜蚜群中的互作研究。有翅蚜"孢子浴"接种新蚜虫疠霉后不同时间间隔(0d,1d,2d)再进行蚜茧蜂处理,试验结果表明:各处理间的蚜虫感病率差异显著,且均高于60%;处理间的僵蚜率则差异不显著,且均低于15%。而有翅蚜先经寄生再"孢子浴"接种的5组不同间隔时间(1d,2d,3d,4d,5d)处理试验的结果表明,组间有翅蚜的僵蚜率呈极显著差异,感病率也呈极显著差异,且僵蚜率和感病率在间隔4 d组出现明显分界。因此,在实验室条件下的有翅蚜蚜群中,新蚜虫疠霉的侵染比烟蚜茧蜂的寄生更具竞争优势,但它们之间的互作关系不是取代关系,而是迭代关系。本试验为蚜虫专性病原真菌(特别是虫霉目真菌)更好地联合蚜茧蜂在蚜虫生物防治中开展应用提供科学依据。

植物次生代谢物对植食性昆虫防御作用的研究进展

次生代谢物在植物应对植食性昆虫防御反应中发挥重要作用。植物被昆虫取食后,会诱导激活植物防御信号通路,进而合成并积累大量植物次生代谢物。植物次生代谢物对植食性昆虫的防御作用方式多样,包括对昆虫产生致死作用、驱避和拒食作用、干扰酶活性、影响其生长发育和繁殖以及影响其体内共生菌,并通过招募昆虫天敌来间接防御。本文阐述了植物次生代谢物对植食性昆虫的防御作用相关研究进展,有助于了解次生代谢物在植物-昆虫互作中的作用,为构建生态友好和可持续发展的绿色防控模式提供理论依据。

不同茭白品种中菰黑粉菌的鉴定及ISSR多态性分析

菰黑粉菌是茭白的内生真菌,对茭白孕茭具有重要作用。本文分离获得了13个不同茭白品种和孕茭表型的菰黑粉菌菌株(M‐T型和T型),ITS序列鉴定分析发现:13个菌株都属于菰黑粉菌,它们的ITS序列仅在ITS1序列区间存在3个碱基位点的变异;基于ISSR技术比较分析了菰黑粉菌菌株间的遗传多态性,聚类分析表明,菰黑粉菌菌株的遗传多态性与茭白栽培特点及孕茭表型密切相关,本研究有助于茭白种质资源的鉴定及保护,并为茭白田间栽培管理提供了技术支持和理论依据。

UeFuz7在菰黑粉菌二型态转换中的作用

菰黑粉菌与茭白植株互作形成膨大肉质茎——茭白,已成为我国第二大水生蔬菜。作为一种二态性真菌,菰黑粉菌的二型态转换与侵染茭白密切相关,对茭白孕茭至关重要。本研究基于菰黑粉菌全基因组序列,采用t Blastn进行同源基因查找,克隆得到了玉米瘤黑粉菌Fuz7的同源基因UeFuz7。该基因c DNA全长1 308 bp,无内含子,编码435个氨基酸,在黑粉菌中相对保守。酵母双杂交实验发现,UeFuz7可与UeKpp2蛋白互作。同时其表达模式分析发现,在菰黑粉菌的二型态转换发生时UeFuz7的相对表达量最高。进一步通过PEG介导的原生质体转化获得UeFuz7突变体,表型分析发现:在二型态转换过程中,UeFuz7突变菌株的接合管形成和菌丝生长能力明显减弱。以上结果表明UeFuz7作用于菰黑粉菌的二型态转换。