Q型烟粉虱化学感受蛋白CSP1与植物挥发物的结合特征

【目的】克隆Q型烟粉虱(Bemisia tabaci)化学感受蛋白1(chemosensory protein 1,CSP1)基因,诱导表达Q型烟粉虱CSP1重组蛋白(以下简称Bt CSP1),研究其与主要寄主植物挥发性气味分子的结合特性。【方法】利用全长引物通过RT-PCR扩增并克隆Q型烟粉虱CSP1基因ORF全长,连接并构建p ET-30a(+)原核表达载体,转化入BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞,并用IPTG诱导表达Bt CSP1重组蛋白。收集菌液后超声破碎细胞,离心取上清,经Ni2+-琼脂糖柱结合梯度浓度咪唑洗脱纯化后,经PBS反复透析获得重组蛋白,并用Bradford法测定重组蛋白浓度。采用常见的N-苯基-1-萘胺(N-phenyl-1-naphthylamine,1-NPN)荧光探针作为报告子,利用荧光竞争结合法研究重组Bt CSP1蛋白与植物挥发物的结合功能。首先用1 mmol·L-1 1-NPN滴定Bt CSP1蛋白溶液,直至蛋白最大发射波长处的荧光值完全猝灭为止,然后再以各供试配基滴定Bt CSP1-1-NPN体系,通过配基竞争猝灭1-NPN最大发射波长,并用Scatchard等方程计算表征Bt CSP1与配基亲和力大小的解离常数KD。【结果】克隆了Q型烟粉虱CSP1基因ORF全长,经双酶切和连接构建了p ET-30a(+)/CSP1重组质粒,在IPTG终浓度为1 mmol·L-1的条件下诱导获得了Bt CSP1重组蛋白,Ni2+-琼脂糖柱纯化透析后测定重组蛋白浓度,稀释至1.5μmol·L-1作为工作浓度。在荧光光谱试验中,Scatchard方程线性化后(相关系数达到0.9967),显示Bt CSP1与1-NPN的解离常数K1-NPN为2.78μmol·L-1,结合位点数n为0.82,表明两者结合较好,且基本是1:1结合,适合作为本试验中竞争性荧光结合试验的报告子。在荧光竞争结合试验中,有多种供试植物挥发物分子能使1-NPN的相对荧光强度降低到50%以下,其中包括能引起烟粉虱趋避行为的化合物,如3-蒈烯、p-伞花烃、顺-3-己烯-1-醇和α-蒎烯(KD值分别为26.47、39.43、54.01和83.46μmol·L-1),且3-蒈烯具有较强的竞争结合能力,能在200μmol·L-1时将1-NPN报告子相对荧光值竞争至约40%。【结论】Q型烟粉虱CSP1蛋白能与测试的多种寄主植物挥发物产生较为广谱的结合能力,尤其与对烟粉虱有趋避性的挥发物的结合更强,表明CSP1很有可能参与Q型烟粉虱对非寄主植物的趋避行为,这对揭示其入侵寄主选择行为生理机制具有重要意义。