基于液相色谱-质谱联用技术的蛋白质类肿瘤标志物定量方法研究进展

液相色谱-质谱(LC-MS)联用技术因具有高通量、高灵敏度等优点而成为发现、验证生物标志物及对生物标志物进行定量分析的有力工具。近年来,LC-MS在临床应用中,特别是在定量肿瘤生物标志物方面做出了重要贡献。研究人员通过不同的设计原理开发出多种定量方法,逐步实现了对高度复杂样品中蛋白质类肿瘤标志物的准确定量。本文从用于定量蛋白质类肿瘤标志物的样品前处理方法及LC-MS分析中的质谱扫描策略两个方面,对近年来的主要定量方法进行总结。

基于LC-MS/MS测定人体类固醇激素的研究进展

类固醇激素是一类具有环戊烷多氢菲结构的化合物,由细胞色素P450酶催化形成,在调节机体代谢、促进性器官发育等方面起着重要作用。临床上将类固醇激素水平作为肾上腺疾病、精神类疾病等的诊断指标。液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)联用技术因具有高灵敏度、高通量和高专属性的特点,已成为类固醇临床测定的首选方法。本文综述了LC-MS/MS在内源性类固醇激素测定中的应用,特别是在样品前处理、色谱条件和质谱条件优化等方面的研究进展,为临床上类固醇激素的诊断检测提供参考。

磷酸化肽段分离富集方法的研究进展

目的:通过综述O-磷酸化肽段和N-磷酸化肽段的富集方法研究进展,为磷酸化蛋白质分析前处理提供解决方案。方法:结合文献和数据库搜索,总结O-磷酸化肽段和N-磷酸化肽段的富集方法基本原理与应用,系统介绍O-磷酸化肽段和N-磷酸化肽段的富集方法研究进展。结果:磷酸化肽段分离富集方法已被广泛应用于磷酸化蛋白质组学研究中。结论:目前已开发了多种针对不同磷酸化肽段的富集方法,不同的方法具有不同的特异性和选择性,因此,根据研究目的选择富集方法尤为重要。

血清蛋白质组高丰度蛋白去除方法比较研究

基于健康人群(HC)和肝癌人群(HCC)的血清样本,本研究比较了高选择Top14高丰度蛋白去除试剂盒(Top14)、DMB低丰度蛋白富集试剂盒(DMB)2种血清蛋白质组前处理方案的优劣势。对于HC样本,DMB处理组鉴定的蛋白质数量是Top14处理组的2.6倍,是未处理血清原液(Blank)样本的3.9倍;对于HCC样本,DMB处理组鉴定的蛋白质数量是Top14处理组的3.7倍,Blank组的6.2倍。通过分析蛋白组的丰度排序散点图,发现Top14预处理对高丰度蛋白质的去除效果显著;但相较于DMB预处理,低丰度蛋白质的鉴定覆盖率较低。在蛋白质组鉴定频率方面,DMB处理样本中可定量蛋白质数量明显多于Top14处理组和Blank组。Top14处理组和Blank组中鉴定的蛋白质超过50%可在DMB处理组中被鉴定到,且其鉴定蛋白质的KEGG分析结果基本可在DMB方案中被覆盖。在DMB预处理的肝癌血清中鉴定到47个差异蛋白质,而在Top14处理组和Blank组中分别只鉴定到15、17个差异蛋白质。通过对各组差异蛋白质编码基因的KEGG分析,DMB、Top14预处理组和Blank样本的差异蛋白质分别富集到21、5、1条通路,表明DMB预处理更适用于血清样本蛋白质组的分析。基于DMB预处理方法,本研究发现HSP90AB1、SPP1、ACTR3、SNCA、PECAM1和SRC在肝癌血清样本中显著上调,可作为肝癌筛查候选生物标志物。

基于Hela细胞的失巢凋亡现象时序评价模型的建立及测量验证方法研究

失巢凋亡作为一种特殊的程序化细胞死亡形式,在机体发育、组织自身平衡、疾病发生和肿瘤转移中起重要作用。利用贴壁增殖表皮细胞系海拉(Hela)细胞作为模型,通过对比贴壁细胞悬浮后悬浮时间对细胞活性的影响,深入探讨了细胞失巢凋亡现象。研究考察了悬浮5 min、30 min、1 h, 2 h, 4 h和8 h后的活细胞数量,以及重新贴壁培养后对细胞活性(即贴壁24 h后活细胞增殖数量)的影响。结果表明:悬浮时间可导致海拉细胞数量减少及活性降低,在细胞实验过程中应当严格控制悬浮细胞接种时长。

基于四极杆-线形离子阱串联质谱技术测量血清25OHD

本研究基于自主研制的QLIT-6610MD四极杆-线形离子阱液相色谱-质谱联用仪,建立了准确测量血清25OHD的同位素稀释质谱法。血清样品用甲醇沉淀蛋白,正己烷液-液萃取,上清液用氮气吹干,初始流动相复溶,QLIT-6610MD测定。采用基质匹配标准曲线定量,25OHD 2和25OHD 3分别在0.78~50μg/L和1.56~100μg/L范围内的线性决定系数R^(2)>0.9999,检出限和定量限为0.06、0.12μg/L和0.02、0.06μg/L,质控品精密度优于4.06%,血清样本添加回收率为99.25%~108.38%,变异系数≤5.10%。用QLIT-6610MD、AB 4500MD和YS EXACT 9900MD 3台液相色谱-质谱联用仪测定50例临床血清,采用Pearson系数和Bland-Altman法分析,3组数据的相关系数R≥0.9980、P<0.01。这表明3台仪器所测结果一致,QLIT-6610MD可以达到三重四极杆质谱仪定量测定血清25OHD的水平,能够满足临床诊断需求,将为临床质谱分析提供一种新型仪器,助力国产质谱仪发展。

肉类掺假检测方法及研究进展

肉类及其制品的质量检测是食品安全的重要保障。过去几十年间,对肉类掺假造假检测已经发展了核酸检测技术、生物传感器、光谱学检测技术、免疫学检测技术和质谱技术等,能准确、快速地定性与定量检测市场上主要肉类及其制品的成分和含量。相关标准物质的研制与应用将进一步提升这些检测方法的准确性和可靠性。综合分析和回顾了肉类掺假分析的主要方法,归纳和总结了这些技术在肉类掺假检测的优点和不足。同时,讨论和展望了肉类及其制品掺假检测的发展趋势,以期对完善和规范我国肉类市场提供一定的参考价值。

一种基于质谱仪的数字滤波器参数设计方法研究

目的:数字滤波器可以提高质谱仪信噪比。针对数字滤波器参数设置不当会降低质谱仪质量分辨率以及浪费系统资源的问题,提出一种数字滤波器参数设计的方法。方法:根据滤波前后质量分辨率变化规律、限定质量分辨率增量以及基线信号强度变化,完成了数字滤波器的窗函数、阶数及最佳截止频率的参数设计。结果:在实验室自主研制的四极杆-线形离子阱串联质谱仪中,使用本方法实现了hamming窗低通数字滤波器的设计,将仪器信噪比提升71%,同时分辨率降低量小于1%。结论:该方法在提高质谱仪信噪比和分辨率的同时,减少了系统资源浪费,为高灵敏质谱仪研发提供了参考方法。

大气压化学电离技术及其应用

目的:介绍了大气压化学电离的基本原理、结构和研究现状,并对大气压化学电离技术在多个领域中的应用进行了整理,对大气压化学电离技术的发展趋势进行了展望。方法:大气压化学电离(APCI)是一种典型的大气压电离方法,是质谱分析技术中的一种电离形式,也是高效液相色谱和质谱分析中的一个主要连接技术。结果:大气压化学电离技术已经在药物检测、环境检测等领域被广泛应用。结论:大气压化学电离质谱具有电离效率高、灵敏度高、稳定性好等优点,可用于电离极性较弱的化合物,且不太容易受到基质效应的影响。

肿瘤细胞外泌体的生物学功能及其检测方法研究进展

外泌体是一类细胞分泌的微小囊泡,其中包含蛋白质、脂质和核酸等重要的生物活性物质。外泌体作为细胞间通讯的重要载体,直接参与机体内肿瘤的发生、发展进程,通过影响肿瘤微环境,进而介导肿瘤细胞的生长和迁移。由于外泌体具有特殊的生理功能,近年来,将其作为重大疾病治疗载体和生物标志物的研究日益增加,针对外泌体的检测方法也得到不断发展。对肿瘤细胞外泌体的生物学功能和检测的近期相关研究进行系统综述,并对检测方法的发展趋势加以展望。

四极滤质器在不同边缘场条件下的离子传输效率研究

四极滤质器(Quadrupole Mass Filter,QMF)因其高灵敏度和高选择性而广泛用于质谱分析。对其操作原理的深入理解对优化其性能至关重要。基于相空间动力学方法和离子运动理论,使用离子光学仿真软件SIMION 8.2,深入研究了四极杆入口端盖与QMF电极间隙对入口边缘场及离子传输的影响。研究结果表明,端盖间隙的大小直接影响不同m/z范围内的离子传输效率。较小的间隙可以优化高m/z值的离子传输,而较大的间隙则有助于优化低m/z值的离子传输。对于质量数范围m/z 1~100 amu时,r_(0)~1.25 r_(0)的间隙大小可使离子传输效率达15.92%~25.80%,比无边缘场时提升了约2.45~3.97倍;对于质量数范围m/z 1~1000 amu时,小于0.5 r_(0)的间隙大小可使离子传输效率达12.06%~26.40%,比无边缘场时提升了约1.86~4.06倍。这项研究为调整端盖间隙以优化所需m/z值范围内的离子传输提供了理论依据,对仪器设计具有一定的参考价值。

自主研制四极杆-线形离子阱质谱仪测定血清中甲氨蝶呤

本研究基于自主研制的QLIT-6610MD液相色谱-四极杆-线形离子阱-质谱联用仪,建立了准确测量血清中甲氨蝶呤的同位素稀释质谱法。采用甲醇沉淀血清样品的蛋白后测定上清液。通过基质匹配标准曲线定量,在10~5000μg/L浓度范围内,甲氨蝶呤的线性系数R^(2)>0.9990,定量限为10μg/L,质控品精密度优于6.94%,血清样本添加回收率为86.39%~97.84%,变异系数(CV)≤8.04%。应用QLIT-6610MD与AB QTRAP 6500+液相色谱-质谱联用仪同时测定70例临床血清样本,并采用Pearson系数与BLand-ALtman法进行比较。结果表明,2台仪器所测结果一致,QLIT-6610MD可达到三重四极杆质谱仪定量测定血清中甲氨蝶呤的水平,能够满足临床诊断需求,为临床质谱分析提供了一种新的国产仪器选择。此外,本研究还初步探讨了多级碎裂技术(MSn)测定血清中甲氨蝶呤的可能性,为后续研究奠定基础。

基于液相色谱-串联质谱技术的治疗药物监测方法研究进展

液相色谱-串联质谱技术具有高特异性、高通量的特点, 因此在临床检验领域有快速的应用和发展, 其在治疗药物监测中的应用可有效提升定量准确性与灵敏度, 为患者制定个性化的最佳给药方案。但该技术目前仍面临一些挑战, 自动化、质量控制、量值溯源等将是今后的发展方向。

接种数量对细胞生长和药物作用的影响及细胞计数方法对比

以海拉细胞作为研究对象,对细胞数量差异引起的细胞生长速率变化以及对药物效果的影响展开研究。实验结果表明细胞起始数量越多,贴壁后密度越大,生长速率越快,并且药物对其生长的抑制作用越低。因此,准确地细胞计数是生物学实验的关键。比较了3种常用细胞计数方法:细胞计数板法、细胞计数仪法、流式细胞仪法,结果显示其线性相关系数R^(2)分别为0.983 5,0.999 7和0.996 0,同等条件下,细胞计数仪具有最高的准确性。同时也对结晶紫染色、底面积拍照、蛋白质含量估算和蛋白质内参GAPDH测量等间接方法进行评估,为生物学实验过程中的细胞数量测算提供数据参考。

四极杆-线形离子阱串联质谱法测量血清中万古霉素

本研究采用自主研制的QLIT-6610MD液相色谱-串联质谱系统,建立了测量血清中万古霉素的高准确度方法。样品经蛋白沉淀和液液萃取后,进入QLIT-6610MD系统分析。样本中的内源性物质在保留时间内对目标物无干扰。结果表明:在1.56~50.0 mg/L范围内,万古霉素的线性关系良好,相关系数(R^(2))≥0.99,检出限和定量限分别为0.19、1.56 mg/L,日内和日间精密度范围分别为1.62%~3.82%和2.07%~5.07%,血清样本的加标回收率为95.97%~97.74%,基质效应归一化因子(CV)≤7.60%,样品保存稳定性CV≤4.26%,进样长时稳定性优于2.13%。通过测定低、中、高质控品对方法进行验证,结果均在靶值范围内。采用QLIT-6610MD、AB API4000和YS EXACT 9900MD 3台液相色谱-串联质谱仪测定42例临床血清样本,经过Deming回归、Bland-Altman分析和Pearson相关性分析,结果具有良好的一致性。本研究证明了自主研制的QLIT-6610MD液相色谱-串联质谱系统能够达到三重四极杆质谱仪的定量水平,可为实时临床分析提供一种新型国产仪器方案。

基于分离重叠谱峰的在线过程质谱气体定量分析方法

在线定量分析工业生产过程的反应气体或尾气,获知各组分气体含量,有助于及时调整生产工艺、提高产品质量,对相关工业的转型升级有着重要的意义。但受工业生产成本的影响,价格高昂的高分辨率质谱仪在工业在线定量分析中的应用相对局限,而采用低分辨率质谱仪检测出的带有重叠谱峰的质谱图可能会对反应气体或尾气的准确定量造成困难。虽然现有的在线定量分析方法较为成熟,但在定量准确度、方法适用性以及设备复杂性方面仍存在优化空间。为实现更准确且高效的在线定量分析,本研究提出了采用在线过程质谱仪对反应气体或尾气进行检测并分离重叠谱峰的定量分析方法。首先,根据工业生产场景精确预估待测反应气体或尾气的各组分气体及其含量,获得预测矩阵并配制校正标气。其次,通过查找各组分气体的标准质谱图,获得校正标气的所有重叠谱峰,根据各组分气体的主峰与重叠谱峰之间的关系构造最简单的比值矩阵,并配制与相关组分气体含量相同的比值标气修正比值矩阵。然后,利用质谱仪测量校正标气获得校正矩阵,并与预测矩阵和比值矩阵构建校正数学模型求得相对灵敏度矩阵。最后,根据计算出的相对灵敏度矩阵、修正后的比值矩阵与测算待测反应气体或尾气后获得的检测矩阵一同构建定量数学模型,实时求得各组分气体的含量矩阵,实现对工业生产过程的实时监测与调控。采用该方法分析具有代表性的酵母菌发酵罐尾气时,表现出准确度高且适用性强的特点,经过多次在线定量分析实验后,其最大定量误差可控制在0.4%以内,最大定量相对标准偏差可限制在2%以内。

四极杆-线形离子阱液相色谱质谱联用法快速检测玉米油中黄曲霉毒素

建立了四极杆-线形离子阱液相色谱质谱联用仪(Liquid Chromatography-Quadrupole-Linear Ion Trap Mass Spectrometry,LC-Q-LIT)测定玉米油中4种黄曲霉毒素(黄曲霉毒素B_(1)、黄曲霉毒素B_(2)、黄曲霉毒素G_(1)、黄曲霉毒素G_(2))的分析方法。选择Phenomenex Kinetex C_(18)色谱柱(2.1 mm×50 mm,2.6μm)分离目标物,分别以0.1%甲酸水-0.1%甲酸甲醇(V/V)为流动相进行梯度洗脱。质谱采用正离子扫描(ESI+)和选择反应监测模式。在玉米油基质中,4种黄曲霉毒素在2.5~50.0 ng·mL^(-1)呈现良好的线性关系(R^(2)≥0.990 3),检测限和定量限在0.5~1.0 ng·mL^(-1)和1.5~2.5 ng·mL^(-1),添加回收率为71.75%~97.87%,RSD≤13.86%。该方法操作简单、快速、成本低且灵敏度高,定性、定量准确,适用于玉米油中黄曲霉毒素的检测分析。

液相色谱-四极杆线形离子阱质谱法快速检测牛奶中磺胺类和喹诺酮类药物残留

为给国产质谱提供检测动物性食品中兽药残留的参考依据,本试验首次基于自主研制液相色谱-四极杆线形离子阱质谱法(LC-Q-LIT),建立了牛奶中磺胺类药物和喹诺酮类药物残留的检测方法。样品前处理采用液液萃取方法,牛奶样品经乙腈提取,正己烷脱脂,取适量提取液,经氮气吹至近干,初始流动相复溶后,进行LC-Q-LIT检测。基质匹配标准曲线按照空白添加的方法进行制备。仪器条件按照色谱峰形及其响应强度进行优化。LC-Q-LIT检测牛奶中磺胺类和喹诺酮类药物的方法学验证指标包括线性范围、检测限和定量限、回收率和精密度。将LC-Q-LIT方法与文献中报道的液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)方法进行对比,并采用LC-Q-LIT方法检测5份实际样品。经优化选择依利特C18色谱柱(4.6 mm×150 mm,5μm)分离目标物;以0.1%甲酸水溶液-甲醇(V/V)为11种磺胺类药物的流动相,0.1%甲酸水溶液-0.1%甲酸乙腈(V/V)为9种喹诺酮类药物的流动相进行梯度洗脱;质谱采用正离子电离(ESI+)和选择反应监测模式。结果显示,在牛奶基质中,11种磺胺类药物在5~500μg/L线性范围内呈现良好线性关系(R^(2)≥0.999),检测限、定量限和添加回收率范围分别为1.0~3.0μg/L、2.5~10.0μg/L和77.39%~119.44%,日内精密度为1.21%~6.04%,日间精密度为2.25%~9.45%;9种喹诺酮类药物在10~450μg/L线性范围内呈现良好线性关系(R^(2)≥0.990),检测限、定量限和添加回收率范围分别为5.0~9.0μg/L、10.0~20.0μg/L和81.97%~118.49%,日内精密度为1.64%~10.94%,日间精密度为2.05%~12.69%。LC-Q-LIT方法的回收率与LC-MS/MS方法相近,可达到仪器准确度要求。5份实际样品经LC-Q-LIT检测,未测出磺胺类药物,测得司帕沙星残留量为0.84μg/L。结果表明,LC-Q-LIT方法操作简单、快速、成本低且灵敏度高,定性和定量准确,适用于牛奶中磺胺类和喹诺酮类药物残留的检测分析。