三株克里米亚刚果出血热病毒中国分离株糖蛋白基因的全序列测定与比较分析

目的 测定克里米亚 刚果出血热病毒 (CCHFV)中国分离株 (即新疆出血热病毒 ,XH FV)BA6 6 0 19、BA840 2及BA8816 6糖蛋白 (M)基因的全部序列并分析各毒株之间的相互关系。方法 病毒RNA在只与其保守末端互补的特异引物PCM Tag和随机引物的共同引发下逆转录成cDNA ,以单一PCM Tag和高保真DNA聚合酶扩增出完整的M基因。扩增产物纯化后作为模板进行序列测定 ,并将所得序列经计算机辅助分析其种系发生与编码策略。结果 XHFV代表株BA6 0 19的M基因与国际原型株IbAr10 2 0 0的M基因比较多 5个碱基 ,为 5 36 5bp ;比BA840 2、BA8816 6多 4个碱基 ,即5 36 4bp。 3株XHFV长ORF起始于M基因的第 78位碱基 ,比IbAr10 2 0 0株提前 15bp。编码的前体蛋白共 16 89个氨基酸 ,比IbAr10 2 0 0株多 6个。 4株病毒之间核苷酸序列的同源性分别为 :80 9%(IbAr10 2 0 0 BA6 6 0 19) ,80 2 % (IbAr10 2 0 0 BA840 2 ) ,80 2 % (IbAr10 2 0 0 BA8816 6 ) ,83 7% (BA6 6 0 19 BA840 2 ) ,83 6 % (BA6 6 0 19 BA8816 6 ) ,99 0 % (BA840 2 BA8816 6 ) ;对应的氨基酸序列的同源性分别为85 1% ,86 3 % ,86 6 % ,87 8% ,88 0 % ,98 8%。它们与Dugbe病毒在核苷酸和氨基酸的同源性较低 ,大约是 5 5 %和 37 7%。

汉坦病毒S基因-多肽噬菌体表面呈现文库的构建

目的：构建汉坦病毒S基因—多肽片断噬菌体表面呈现文库，以期筛检出抗汉坦病毒InAb识别的病毒核衣壳蛋白抗原表位。方法：用DNaseI随机降解汉坦病毒76－118株S基因，回收50bp～300bp小的DNA片断，与克隆接头连接后插入经SfiI线性化的噬菌体载体fuse5，电穿孔导入MC1061菌建库。转化菌培养扩增后提取重组噬菌体，感染K91细胞测定库容，并随机挑选若干克隆测序。结果：构建的S基因噬菌体文库库容（以转导单位TU表示）为3．375X1010。抽检的8个克隆中有5个含有4种大小和组成不同的正确插人的S基因片断，另外3个克隆均为野生型载体的回复突变。结论：所建文库有足够大的库容和较好的多样性，预计可以满足筛检汉坦病毒核衣壳蛋白抗原表位的需要。

流感病毒中和性基因工程Fab抗体的研制

目的 获得基因工程抗流感病毒抗体 ,为检测其粘膜用药在动物模型中的抗病毒效果奠定基础。方法 从酶联免疫吸附试验阳性的人外周血中分离淋巴细胞 ,提取总RNA ,Oligo dT逆转录cDNA ,聚合酶链反应扩增人IgG轻、重链基因 ,利用pComb3载体构建噬菌体抗体库。用纯化的流感病毒A Sydeny 5 97(H3N2 )为固相抗原筛选抗体Fab段 ,并在大肠埃希菌中进行分泌性表达。通过血凝抑制实验、免疫荧光实验和病毒中和实验选择具有中和作用的Fab抗体。结果 分离到两株Fab克隆 ,IV 2和IV 6 ,流感病毒抗原和抗Fab抗体直接ELISA检测阳性 ,间接免疫荧光实验呈阳性。它们都具有血凝抑制作用 ,病毒中和实验显示能使病毒滴度下降 30倍和 2 0倍。结论 获得了两株具有病毒中和活性的人源抗流感病毒悉尼株的Fab段抗体 ,为进一步的表达纯化及粘膜给药研究其抗病毒效果提供材料。

麻疹病毒CC-47株非编码区核苷酸序列测定与比较

目的 测定麻疹病毒疫苗株长 47(CC 47)的非编码区核苷酸序列 ,并和其他麻疹病毒比较 ,为利用疫苗株病毒进一步研究奠定基础。方法 用RT PCR分段扩增并克隆麻疹病毒CC 47株基因组全序列 ,用基因特异引物测定非编码区的核苷酸序列。结果 CC 47疫苗株非编码区在基因组上为 7个不连续的片段 ,总计 1791个核苷酸。与其他野毒株及Edmonston衍生 5株疫苗株非编码区序列比较发现 ,CC 47疫苗株具有与Edmonston疫苗株系列相同的 4个特征性的核苷酸替代位点 ,分别位于基因组 3′末端第 2 6位 (U→A)、42位 (U→G)和M F基因间隔区FmRNA 5′非翻译区的 4978位(A→G)、5 34 9位 (A→G) ,这些位点的改变可能会影响病毒mRNA的合成、加工和翻译效率以及基因组的复制和包装。结论 不同基因型麻疹病毒具有同样的位点改变可能与病毒在半许可细胞中适应或减毒有关 。

汉坦病毒A9株L片段部分核苷酸序列分析

目的 测定我国分离的汉坦病毒A9株L片段的部分核苷酸序列。方法 用逆转录 聚合酶链反应 (RT PCR)技术扩增我国分离的汉坦病毒A9株部分L片段cDNA ,测定PCR产物的核苷酸序列。结果 PCR扩增产物为L片段 40 0 6nt 44 5 41nt(根据 76 118株序列 ) ,和已发表的汉坦病毒L片段序列比较 ,A9株和汉滩病毒 76 118株同源性最高 ,为 85 .2 % ,和其他不同型别汉坦病毒代表株HR80 39、CG182 0、Sotkoma、NHR11、TulaL片段的同源性分别为 76 .8%、72 .3%、71.0 % ,71.7%和 70 .8%。比较推测的氨基酸序列 ,和 76 118株同源性为 96 .7% ,和HR80 39、CG182 0、Sotkoma、NHR11、TulaL片段的同源性分别为 88.3%、78.6 %、74.7% 74.0 %和 76 .0 %。遗传进化分析显示A9株L片段的进化和同为亚洲黑线姬鼠分离的 76 118株较密切 ,和从欧洲、美洲其他动物分离病毒相差较远 ,提示汉坦病毒的进化和宿主动物密切相关。结论 汉坦病毒A9株和其他不同型别汉坦病毒L片段核苷酸序列的同源性在 85 %～ 70 .8%之间 ,和汉坦病毒原型株 76 118株的同源性最高。