轮状病毒非结构蛋白NSP4研究进展

轮状病毒 (rotavirus,RV)是病毒性腹泻的主要病因。NSP4 (nonstructural protein4 )作为轮状病毒的一种非结构蛋白 ,在病毒形态发生和致病性中发挥重要作用 ,近年来日益受到重视。本文就 NSP4的研究进展作一综述。

成人轮状病毒腹泻

病毒性腹泻过去也叫做非菌性腹泻,临床上早有报导,可是其病因学是十多年前才开始突破,七十年代以来,连续地发现了儿童和婴幼儿里流行的诺瓦克病毒和普通轮状病毒。由于这些病毒侵犯的对象是五岁以下的婴幼儿,因而常被人们统称做婴幼儿腹泻。

中国部分城市A组轮状病毒感染状况调查及VP7血清型分析

目的 研究我国A组轮状病毒感染状况及VP7血清型分布。方法 利用PAGE电泳检测北京、沈阳、新乡、上海、深圳、广州六个城市 1997和 (或 ) 1998年秋冬季婴幼儿腹泻A组轮状病毒的感染状况 ,并采用RT PCR方法对 4种主要的VP7血清型 (G1、G2、G3和G4型 )进行分型。结果 374份标本中有 181份为轮状病毒阳性 ,检出率 48 4%。各地标本的检出率在 32 %～ 6 3 %之间 ,北京、上海地区两年的检出率基本近似。阳性标本经PCR分型方法鉴定G1、G2、G3和G4型的感染率分别为 89 5 %、6 1%、2 8%和 0。有两例为G1和G2型混合感染 ,另有 1例经测序证实为G9型。各地之间、每年之间RV的流行状况略有差异。结论 G1。

CD40反义RNA的构建及其诱导Balm细胞凋亡

目的：探讨ＣＤ４０反义ＲＮＡ对Ｂａｌｍ细胞的影响。方法：用ＲＴＰＣＲ法从人扁桃体细胞获得ＣＤ４０ｃＤＮＡ，双脱氧终止法测序正确后，构建编码膜内段ＣＤ４０基因的反义ＲＮＡ表达载体（ｐｃＤＮＡ３ＣＤ４０），将其导入人Ｂ细胞株Ｂａｌｍ细胞。结果：发现转导后细胞生长代谢受抑，细胞体积缩小，有细胞碎块脱落，ＦＡＣＳ检测出现典型凋亡峰；细胞发光减弱，发光值明显低于正常对照组及转导空载体组（Ｐ＜０．０１），与放线菌素Ｄ（ＡｃｔＤ）、氨甲喋呤（ＭＴＸ）、肿瘤坏死因子（ＴＮＦ）处理组有相似的形态及发光改变。结论：提示ＣＤ４０反义ＲＮＡ特异性阻断了ＣＤ４０正常功能的发挥，导致细胞凋亡。

HIV-1 vpr基因表达载体pAFVPRA的构建

目的 构建可在肝癌细胞中特异性表达人HIV 1vpr基因的重组表达载体。方法 用PCR的方法从 pBSX CYPYVPR xcTHY(简称vpr质粒 )中扩增HIV 1vpr基因片段 ,克隆到pGEM T载体中 ,构建克隆载体 pGEM T/vpr,切下vpr片段后插入到 pCI质粒中 polyA的上游 ,构建中间载体pCI/vpr ,再切下vprA(vpr+polyA)插入到pAF5 .1中AFP启动子的下游 ,从而把AFP启动子和polyA尾分别克隆到vpr基因的上游和下游 ,构建成 pAFVPRA载体。 结果 成功构建了带有AFP启动子和polyA尾的载体 pAFVPRA。结论 pAFVPRA质粒构建成功后 ,可进一步通过合适的方式把HIV 1vpr基因导入肝细胞 。

一种快速高效分离和纯化重组腺病毒伴随病毒载体的方法

利用2型腺病毒伴随病毒(adeno-associated virus type 2, AAV-2)能够抵抗氯仿的特性, 采用"氯仿处理-PEG/NaCl沉淀-氯仿抽提" 3个步骤分离、浓缩和纯化重组腺病毒伴随病毒(recombinant adeno-associated virus, rAAV), 整个纯化过程可在4 h内完成. 最终从5个转瓶生长的4×109个载体生产细胞中可得到5×1013 病毒颗粒/mL, SDS-聚丙烯酰胺凝胶结果表明, rAAV的纯度大于95%, 电子显微镜下绝大多数病毒颗粒的结构完整. 纯化后的rAAV仍保持较强的感染性, 其感染性滴度达到2×1012 转导单位(transducing unit, TU)/mL, 总的病毒颗粒数与感染性病毒颗粒数的比值为25. 为rAAV 大规模生产后的纯化提供了一种简便、快速、低成本的方法.

检测β_3-整合素基因在汉坦病毒敏感细胞中的表达

目的 克隆表达 β3 整合素基因 ,制备抗体 ,并用之进行 β3 整合素表达阴性Vero细胞的分离和富集。方法 采用RT PCR扩增克隆 β3 整合素基因 ,亚克隆至pQE30表达质粒 ,在原核细胞中表达 ,免疫印迹实验确证其表达及免疫反应性。纯化蛋白免疫接种家兔制备抗体 ,补体介导的抗体依赖性的细胞毒实验分离富集目的细胞 ,免疫荧光及免疫印迹检测筛选结果。结果 成功克隆 β3 整合素基因 ,并在pQE30表达系统中得到高效表达。免疫印迹证实所表达的 β3 整合素蛋白具有良好的免疫反应性。制备了高效抗体 ,免疫荧光及免疫印迹均未检测出 β3 整合素在Vero、VeroE6、Hep 2 ,2BS和 2 93等汉坦病毒敏感细胞表面的表达。结论 除 β3 整合素外 。

G1型轮状病毒中和抗原VP7基因变异特点

目的 研究我国G1型轮状病毒主要中和抗原VP7基因的变异特点。方法 对 1988～1998年收集自北京、沈阳、新乡、上海、深圳、广州、重庆等 7个城市的 2 3份G1型轮状病毒毒株VP7cDNA序列进行测定 ,并结合核酸电泳带型和G1型单抗的ELISA检测结果分析VP7基因的变异特点。结果 我国G1型轮状病毒VP7变异有一定规律 ,主要集中在aa41、49、5 7、65、68、74、94、97、147、170、2 17、2 18、2 68、2 81、2 91,即VR3～ 5、VR7～ 8以及多肽C端的部分区域内。各地区之间没有明显差别 ,虽然随时间不同个别氨基酸可能发生替换 ,但仍同属Jpn 417支系 ;aa91位可能参与构成G1型VP7的抗原表位 ,某些位点的氨基酸变异可能与核酸带型改变有关。结论 在研制疫苗时 ,应采用基因和抗原性具有代表性的近期毒株 。

HPV16 L1/E6-E7基因嵌和DNA疫苗质粒构建及其在CHO细胞表达的初步研究

目的 构建HPV 16L1 E6、HPV16L1 E7预防、治疗性DNA疫苗质粒。方法 运用PCR大引物定点诱变法逐个突变E6、E7基因与转化作用有关的位点 ,PCR产物连接至pGEMT Easy质粒 ,测序鉴定突变基因正确后 ,分别均与L1基因共同连接并至真核表达载体pVAX1,得到真核表达质粒1MpVAX1 L1E6,2MpVAX1 L1E6,1MpVAX1 L1E7,2MpVAX1 L1E7,3MpVAX1 L1E7。运用磷酸钙法将所获得的质粒转染CHO细胞 ,以HPV 16L1特异性单克隆抗体进行转染细胞中L1蛋白表达的ELISA和免疫组化的检测。结果 ELISA检测显示转染各种L1 E6、L1 E7融合蛋白表达质粒的细胞提取物的P N值均 >2 .1;免疫组化检测在胞质胞核可见棕黄色点状阳性产物沉积。结论 所构建的L1 E6、L1 E7融合蛋白表达质粒可在体外表达L1蛋白 。

亚洲部分地区正常人群中成人腹泻轮状病毒抗体水平调查

目的 调查亚洲部分地区正常人血清中成人腹泻轮状病毒 (ADRV)抗体水平。方法 采用特异敏感的ADRV ELISA阻断实验 ,检测长春、南京、太原、武汉、香港、尼泊尔、韩国等亚洲部分地区正常人血清中ADRV抗体。结果 2 183例正常人血清中有 79份ADRV抗体阳性 ,阳性率为3.6 % ;在中国大陆几个地区和香港地区不同年龄组的正常人血清中 ,ADRV抗体水平较低的年龄组为 10～ 2 0和 2 0～ 30岁 ;1977年香港地区正常人群血清中测出有ADRV抗体 ,表明 1983年中国大陆发生ADRV暴发流行之前 ,香港地区曾有ADRV存在 ;观察了 1986年至 1991年 6年间香港地区正常人群人ADRV抗体水平 ,未发现有明显不同 ;在尼泊尔、韩国正常人血清中也有ADRV抗体。结论 正常人血清中ADRV抗体水平比较低 ,阳性率仅为 3.6 %。

牙龈卟啉单胞菌prtH基因克隆及其多态性的研究

目的 建立牙龈卟啉单胞菌 (Porphyromonasgingivalis,P g)prtH全基因序列的克隆株 ,分析 5株不同P g菌株中prtH基因多态性。方法 利用PCR技术获得prtH全基因序列 ,克隆至载体pGEM T ;设计 3对引物 ,用PCR的方法扩增prtH基因的不同区域 ;以生物素标记prtH基因序列为特异性探针 ,用斑点杂交和Southern印迹杂交进一步分析prtH基因的多态性。结果 酶切分析和DNA测序证实重组质粒pGEM T prtH的插入片段为prtH基因序列 ;核酸分子杂交显示菌株W 381和ATCC 332 77杂交类型一致 ,菌株ATCC 4941 7和菌株 1 4 3 2呈现各自不同的杂交条带 ,而菌株 47A 1中未检测到prtH基因。结论 不同P g菌株中prtH基因序列存在差别 ,这种基因多态性提示不同P g菌株毒力大小可能存在差异。

我国各血清型轮状病毒非结构蛋白NSP4基因特征的初步分析

目的 对我国血清学调查中发现的四型 (G型 )轮状病毒NSP4序列进行测定和分析 ,了解NSP4的基因类型和变异状况。方法 利用银染测序方法对G1、G2、G3、G9型毒株NSP4cDNA序列进行测定。结果 四个血清型毒株NSP4的核苷酸和氨基酸序列的同源性分别为 78 8% ,93 5 % ;83 0 % ,95 5 %。G1、G3、G9型标本多属Wa组 ;G2型标本多属KUN组。NSP4的变异主要位于VP4结合域内的 135 145位氨基酸。结论 Wa组和KUN组是我国主要的两种NSP4基因型。

5型腺病毒载体的改建

腺病毒载体是一个良好的真核表达载体，已有多种外源基因在５型腺病毒载体得到表达。病毒学研究所形态室八十年代中期从国外引进了Ｅ３区缺失的５型腺病毒载体，并应用该载体表达了Ｂ组轮状病毒第５基因和乙型肝炎表面抗原基因，在使用过程中发现该载体有以下缺点，１．载...

青岛市幼儿园儿童巨细胞病毒感染的调查

青岛市幼儿园儿童巨细胞病毒感染的调查徐洪涛，邵济钧，温瑞福（青岛医学院微生物学教研室，山东２６６０１２）人类巨细胞病毒（ＨＣＭＶ）是目前引起先天性病毒感染最常见的病因。１岁以下小儿ＨＣＭＶ感染主要是从母体经胎盘、产道或乳汁获得，１岁以上学龄前儿童ＨＣ...

人S100蛋白的表达及其抗血清的制备和脑脊液中S100含量测定方法的建立

目的 建立定量检测脑脊液 (CSF)及血清中S10 0蛋白的方法 ,探讨S10 0蛋白的检测在辅助诊断克 雅病 (CJD)中的应用。方法 利用脑cDNA文库 ,经PCR获得了S10 0基因并克隆至原核表达载体pGEX 2T上 ,在大肠埃希菌中表达了谷胱甘肽 S 转移酶 (GST) S10 0融合蛋白 ;融合蛋白经亲和纯化后 ,免疫家兔 ,制备抗体 ;抗体经纯化后 ,用生物素 (BNHS)标记 ,建立了可定量检测S10 0蛋白的生物素 亲和素系统ELISA方法 ,并初步用于临床脑脊液的检测中。结果 所表达的GST S10 0蛋白相对分子质量约为 35 0 0 0 ,以其为抗原制备的S10 0特异性抗血清具有良好的免疫反应性。建立了定量检测脑脊液中S10 0蛋白的双抗体夹心ELISA方法 ,对 3例“可能性的CJD”患者 (14 3 3蛋白阳性 )和 15例无痴呆症状患者脑脊液进行检测 ,结果显示 ,3例CJD患者脑脊液S10 0含量均超过2 90 0 μg/L,而在无痴呆症状患者组中 14例患者脑脊液S10 0含量都低于 0 .180 μg L。对正常人和CJD患者血清进行检测 ,显示S10 0蛋白含量个体间差异很大。结论 所建立的方法可用于脑脊液中S10 0蛋白的检测 ,进一步扩大标本量有助于明确脑脊液中S10 0蛋白的检测在辅助诊断CJD中的价值。

以原核细胞表达的人PrP蛋白为抗原制备抗人朊蛋白抗体

目的 制备针对朊蛋白的特异性抗体。方法 以初步纯化的原核细胞表达的GST PrP融合蛋白免疫家兔 ,制备朊蛋白特异的抗体。结果 以GST PrP s为抗原 ,用酶联免疫吸咐试验(ELISA)检测免疫家兔血清中的朊病毒抗体效价最高可达至 12 80 0 0。Westernbolt检测显示所制备的抗体不仅可以与体外表达的全长及不同C 末端缺失的人朊蛋白反应 ,而且能够识别人、鼠脑组织中内源性朊蛋白。结论 利用GST PrP融合蛋白可有效地剌激免疫动物产生PrP特异性抗体 ,所制备的抗血清可试用于朊蛋白的检测。

染色体外游离态的子宫颈癌HPV16分离株E1/E2区的基因序列重排

目的 观测子宫颈癌组织中呈染色体外质粒状态的HPV 16分离株E1/E2基因序列。方法 Southern转印杂交检测癌组织中HPV 16基因组的物理状态 ,对 8例游离状态的HPV 16分离株E1/E2区进行PCR扩增 ,克隆后酶切分析和DNA序列分析。结果 对 2 8例HPV 16阳性子宫颈癌中病毒DNA杂交结果显示 8例呈染色体外质粒方式存在。PCR克隆鉴定发现 8例分离株都具有完整的E1/E2区域。此外 4例分离株还带有不同比率的基因重排 ,序列检测证实E1/E2区存在有不同的重复序列插入、缺失。 8例分离株中仅 1例带有与HPV 16原毒株相同的 1138位点“G”缺失。结论 在游离态的HPV 16分离株E1/E2区域存在有不同的基因序列重排 ,这可能在病毒致癌方面起一定的作用。

HPV16 YY1位点突变株诱导的永生化细胞系具有部分转化细胞特征

目的 检测HPV 16YY1位点突变株诱导的包皮角原细胞永生化细胞系的生物学特性。方法 提取永生化细胞株蛋白 ,以Westernblot检测细胞内源性p5 3蛋白含量 ;以TRAP法检测细胞中端粒体酶活性 ;将永生化细胞系接种于含有 10 %FCS的软琼脂培养基 ,观测细胞的软琼脂生长能力。结果 Westernblot检测结果显示 4株永生化细胞系中p5 3均为阴性 ;端粒体酶活性均为阳性 ,并且随着细胞传代活性增强 ;在细胞传代初期各细胞系在软琼脂层上不能生长 ,而后期 3株细胞系在软琼脂生长形成集落。结论 HPV