表达野生型和突变型HPV16-E7重组痘苗病毒诱发的抗肿瘤免疫反应

目的 选出适合于治疗性疫苗研制的HPV16E7突变基因。方法 对表达野生型和突变型E7蛋白的重组痘苗病毒所诱发的细胞免疫反应和抗肿瘤活性进行比较研究。结果 表达突变型ME7 1(2 4G2 6G)的重组痘苗病毒VmE7 1与表达野生型E7的VwE7相同 ,可诱发特异性抗体和CTL的产生 ,明显推迟成瘤时间并且保护部分小鼠抵抗肿瘤细胞的攻击 ;而表达突变型ME7 2(2 4G2 6G91G)的重组痘苗病毒VmE7 2免疫小鼠后难以有效的激发细胞免疫反应 ,在抗肿瘤移植实验中也不具明显的免疫保护作用。结论 E7突变基因ME7 1可作为候选基因用于HPV16治疗性疫苗的研制。

共表达HPV16型E6和E7突变基因重组痘苗病毒的构建及其抗肿瘤免疫效果的观察

目的 构建用于子宫颈癌治疗的HPV16型E6和E7重组痘苗病毒实验性疫苗株 ,并对其抗肿瘤免疫效果进行初步评价。方法 以痘苗病毒为载体、利用同源重组技术构建共表达HPV16E6和E7基因的重组痘苗病毒。该病毒免疫C57BL 6小鼠后 ,检测其免疫原性和抗移植瘤生长情况。结果 PCR结果显示 ,重组病毒VmE6E7的TK基因内插入了分别由痘苗病毒早晚期启动子H6和7.5K表达的ME6和ME7 1基因。动物实验结果表明 ,rVmE6E7在C57BL 6小鼠体内可诱发E6和E7特异性抗体产生 ,被免疫小鼠能够抵抗HPV16E6E7转化的同系肿瘤细胞的攻击。结论 获得 1株用于宫颈癌治疗的HPV16型实验疫苗株 ,为进一步研制人用HPV16型疫苗株奠定了基础。

表达HPV16 E6和E7蛋白的非复制型重组痘苗病毒诱发的抗肿瘤免疫反应

目的 观察表达人乳头瘤病毒 (HPV) 16E6和E7蛋白的非复制型重组痘苗病毒的抗肿瘤免疫效果。方法 以重组痘苗病毒NTVJmE6E7免疫C5 7BL/ 6小鼠 ,检测特异性的细胞毒性T淋巴细胞 (CTL)活性 ;经免疫后的小鼠以TC 1肿瘤细胞攻击 ,观察免疫保护效果 ;荷瘤小鼠切除肿瘤后接种重组痘苗病毒 ,观察肿瘤复发情况。结果 以重组痘苗病毒NTVJmE6E7免疫小鼠 ,可诱导产生针对TC 1细胞的特异性的CTL反应 ;加强免疫后的小鼠能耐受 1× 10 4TC 1细胞的攻击 ;以重组痘苗病毒NTVJmE6E7免疫肿瘤术后小鼠 ,能有效地预防肿瘤复发。结论 非复制型重组痘苗病毒NTVJmE6E7可作为HPV16的相关肿瘤及其癌前病变免疫治疗的候选疫苗。

表达HPV16型结构蛋白的非复制型重组痘苗病毒的构建与鉴定

目的 构建表达人乳头瘤病毒 16型 (HPV16 )结构蛋白的非复制型重组痘苗病毒人用疫苗株。方法 采用聚合酶链反应技术 (PCR)扩增并克隆HPV16主要结构蛋白L1和次要结构蛋白L2基因 ;将经过结构修饰的L1和L2基因插入痘苗病毒表达载体 ,通过与痘苗病毒在宿主细胞中同源重组后 ,筛选共表达L1 L2蛋白的重组痘苗病毒并对其进行鉴定。结果 DNA序列分析证实PCR扩增所获L1和L2克隆基因是正确的 ;斑点杂交结果表明重组病毒基因组中有L1和L2基因插入 ;该重组病毒在人源细胞中不复制或低水平复制 ,但可稳定表达相对分子质量为 5 70 0 0的L1蛋白和相对分子质量为 90 0 0 0的L2蛋白。结论 获得 1株稳定表达HPV16L1 L2蛋白的非复制型重组痘苗病毒人用疫苗株。

人乳头瘤病毒16型E6和E7基因突变体表达蛋白的稳定性和抗原性分析

目的 筛选适合于宫颈癌治疗性疫苗研制的人乳头瘤病毒 1 6型 (HPV1 6)E6和E7突变基因。方法 采用定点诱变技术对E6和E7基因进行改造 ,得到几种E6和E7基因的突变体 ;构建成表达野生型和突变型E6与E7的重组痘苗病毒 ,对这些重组痘苗病毒表达的E6和E7蛋白的稳定性及其免疫原性进行了比较研究。结果 E6蛋白第 50位氨基酸的突变、E7蛋白第 2 4和 2 6位氨基酸的突变都不影响蛋白的稳定性和抗原性 ,但E7蛋白第 91位氨基酸的突变使E7蛋白的稳定性和抗原性大大减弱。结论 证实了E7蛋白C 末端的锌指结构对E7蛋白结构的完整性和稳定性是非常重要的。

人乳头瘤病毒58型L1壳蛋白在原核细胞中的高效表达及抗体制备

目的 人乳头瘤病毒 5 8型 (HPV5 8)是重要的高度致瘤性病毒之一 ,用原核细胞表达HPV5 8L1主要壳蛋白 (McP) ,并制备相应抗体血清 ,为基因工程疫苗研制打下基础。方法 用聚合酶链反应 (PCR)扩增HPV5 8L1完整编码区基因 ,并克隆、测序。构建原核表达载体pRSETB 5 8L1,表达的L1蛋白经SDS PAGE纯化 ,免疫BALB c小鼠。结果 在原核细胞中表达了HPV5 8L1壳蛋白 ,该壳蛋白的相对分子质量为 6 0 0 0 0 ,此蛋白与HPV16L1抗体有交叉反应。获得抗HPV5 8L1壳蛋白特异性抗体 ,抗体滴度为 1∶80 ,并用该抗体鉴定了昆虫细胞中表达的HPV5 8L1壳蛋白。结论 HPV5 8壳蛋白在原核细胞中获得有效表达 ,纯化免疫小鼠后能产生抗HPV5 8L1特异性抗体 ,此抗体可用于鉴定真核细胞表达的HPV5

人乳头瘤病毒16型结构蛋白在昆虫细胞中的表达

目的 在昆虫细胞中表达人乳头瘤病毒 16型 (HPV16 )结构蛋白 ,为HPV16型预防性基因工程亚单位疫苗的研究以及诊断试剂的研制奠定基础。方法 将目的基因克隆至杆状病毒转移载体 ,该重组质粒DNA与线性化的杆状病毒DNA共转染昆虫细胞Sf 9,通过同源重组获得重组杆状病毒 ,用SDS PAGE凝胶电泳和Westernblot法检测重组子在昆虫细胞中表达的目的蛋白。结果 获得了稳定高效表达HPV16结构蛋白的重组杆状病毒 ,L1和L2蛋白的相对分子质量分别为 5 70 0 0和970 0 0 ,L1蛋白的表达产量约占昆虫细胞总体蛋白的 2 5 %～ 30 %。结论 人乳头瘤病毒