表达新城疫病毒HN基因的重组火鸡疱疹病毒的构建

应用聚合酶链反应 (PCR)技术 ,用设计带有限制性酶切位点的特异地扩增了从起始密码子开始的 1 8kb新城疫病毒 (NDV)血凝素 神经氨酸 (HN)基因开放式阅读框 (ORF) ,然后插入 pTK2 B的NheI位点 ,构建了含NDVHN基因的插入载体 pTKHN1和 pTKHN2 ,将其与感染火鸡疱疹病毒 (HVT)细胞的总DNA共转染鸡胚成纤维细胞 (CEF) ,经有限稀释法和Dot blot筛选 ,得到含有HN基因的重组体rHVT1和rHVT2 。对重组体进行组织培养传代和Westernblot分析 ,表明重组体在感染细胞中表达了HN蛋白 ,重组体在CEF上的生长特性与亲本病毒相同 ,且在连续传代过程中保持稳定。

肠道病毒感染和克山病病因关系的探讨

先后采用长片段 RT- PCR、间接酶联免疫吸附法 (EL ISA )以及特异性柯萨奇病毒 B3RT- PCR对四川省冕宁县、喜德县、德昌县克山病病区潜慢型克山病患者血清中肠道病毒、血清中 CVB1～ 6 Ig M和 CVB1～ 6 Ig G及血清 Ig M或 Ig G阳性者血中的柯萨奇病毒 B3分别进行检测。结果显示 :1肠道病毒检出率较高 ,为 6 0 % ;2潜在型、慢型克山病组血清CVB1～ 6 Ig M抗体阳性率明显高于健康对照组 (33% vs0 % ,P<0 .0 5 )。结果提示 :病区潜、慢型克山病患者有肠道病毒感染存在 。

pcDNA3肿瘤坏死因子α真核表达载体的构建及其在真核细胞中的表达

目的 构建pcDNA3肿瘤坏死因子α(Tumor necrosis factor-alpha,TNFα)真核表达质粒并了解其在真核细胞内的表达。方法 用双酶切方法由pBluescript/TNFa克隆载体上切下702hp的INFa基因片段,将其克隆至pcDNA3真核表达载体上,经酶切鉴定及测序分析并以脂质体介导法转染真核细胞,了解其在真核细胞内的表达及其表达蛋白的生物学活性。结果 pcDNA3 TNFa重组体经酶切后出现699 bp片段,测序分析与文献报告结果完全一致,表明重组pcDNA3 TNFa表达质粒克隆成功。可见pcDNA3 TNFa质粒在真核动物细胞中得到表达,TNFa蛋白能够杀伤L_(929)细胞,表明重组质粒能在真核动物细胞中表达出具有生物活性的TNFa蛋白。结论 以脂质体介导pcDNA3 TNFa质粒转染真核细胞为基因治疗奠定了一定基础。

两种新型IFNα的克隆、表达及其抗骨肉瘤活性

目的构建两种新型ＩＦＮ突变株及其母体的原核表达系统，表达后对比检测其抗骨肉瘤活性。方法以重组噬菌体ｐＣＡＮＴＡＢ５Ｅ－ＩＦＮｓ为模板，ＰＣＲ扩增出两种ＩＦＮａｌｃ／８６Ｄ突变株及其母体的ＤＮＡ序列，插入原核表达载体ｐＢＶ３２０３。表达、纯化后进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳鉴定、Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测其免疫活性、Ｍ１Ｔ比色法对比检测其抗骨肉瘤细胞（ＯＳ７３２）增殖的活性。结果 酶切及ＰＣＲ鉴定证明ＩＦＮｓ在表达载体上均已克隆成功。两种突变ＩＦＮｓ的抗骨肉瘤活性分别比ＩＦＮａｌｃ／８６Ｄ提高４和１６倍。结论 两种新型ＩＦＮｓ突变体的原核高效表达系统构建成功，体外实验中证明其ＩＦＮｓ蛋白产物抗ＯＳ７３２细胞增殖的活性高于母体。