分子动力学模拟研究利妥昔单抗国际标准品中人血清白蛋白的活性保护机制

目的研究利妥昔单抗(rituximab)国际标准品中不同比例人血清白蛋白(HSA)作为冻干保护剂对蛋白分子的保护作用及其作用机制。方法使用Gromacs5.0.5工具包,在300 K的温度条件下,运用计算机模拟的方法,搭建模型,分别模拟分析HSA与利妥昔抗原结合片段(Fab)的分子数比分别为1:1、2:1和3:1状态下的分子结构,从结构生物学的角度比较并分析不同比例人血清白蛋白对利妥昔分子的保护机制。结果不同比例的HSA保护剂在一定程度上可以通过与rituximab Fab分子的相互作用来改善蛋白分子表面的亲疏水性质,阻止无规则卷曲结构的形成,从而保护rituximab Fab的天然构象不被破坏,且在1:1、2:1和3:1三种模拟体系中,HSA与rituximab Fab的分子数比例为2:1时保护效果最好。结论当人血清白蛋白与利妥昔Fab的分子数比为2:1保护效果最佳,可为其他单抗标准品的开发提供参考依据。

体外诊断试剂行业标准制定工作的现状分析及展望

该文简单介绍了标准的工作程序,总结了体外诊断试剂行业标准工作的重要性,对近10年的工作情况做了汇总分析,提出了在立项、参与度、与标准物质的联系、人才建设、制定周期等方面存在的问题和解决办法,展望了未来发展。

基因芯片法检测中国人乙醛脱氢酶2的基因多态性

目的:对中国人乙醛脱氢酶2(ALDH2)的基因多态性进行检测,指导临床硝酸甘油的合理用药。方法:采用显色基因芯片方法测定ALDH2基因(Glu504Lys)多态性。结果:对1 026例中国人群临床样本的检测,获得3种基因型,分布频率为:ALDH2(504Glu)野生纯合子61.7%(623例),ALDH2(Glu 504Lys)杂合子31.6%(319例),ALDH2(504Lys)突变纯合子6.6%(67例)。结论:中国人群对硝酸甘油无效概率高的患者大约占1/3。本文建立的检测方法适合医院开展常规临床指导用药的基因检测。

基于硼酸亲和色谱(BAC)测定单抗糖化比例方法的建立

目的:建立基于硼酸亲和色谱(BAC)测定单抗糖化比例分析方法并进行方法学验证。方法:对硼酸亲和色谱做方法优化和方法学验证,通过对流动相的盐组成、NaCl和Tris浓度的优化,建立能够有效定量单抗糖化比例的BAC分析方法,并对该方法进行方法学验证和应用评价。结果:NaCl和Tris浓度的变化会影响单抗糖化比例的检测,通过参数优化,最终确定在NaCl和Tris浓度分别为300 mmol·L^(-1)和25 mmol·L^(-1)时,可以对单抗糖化比例进行准确定量。根据ICH Q2和《中华人民共和国药典》2020年版对建立的方法进行了方法学验证,结果表明该方法具有良好的特异性、准确性、精密度和耐用性。单抗糖化比例在2%~90%有良好的线性,R^(2)大于0.99,回收率在87.04%~115.29%;非糖化比例在10%~98%具有良好线性,R^(2)大于0.99,回收率在99.69%~109.79%。精密度结果表明,该方法整体的RSD值小于18.26%。最后,利用建立的方法对利妥昔单抗原研药和生物类似药进行了糖化比例检测,发现同一厂家不同批次利妥昔单抗糖化比例差异较小,而不同厂家糖化比例存在差异。结论:建立的BAC糖化比例测定方法具有良好的准确性和精密度,可用于利妥昔单抗糖化比例的检测。

婴幼儿人群中CVA16中和抗体与CVA16手足口病的相关性研究

目的分析婴幼儿中柯萨奇病毒A组16型(coxsackievirus A16,CVA16)中和抗体对CVA16手足口病(hand-foot-mouth disease,HFMD)的预防作用。方法随访2012年1月—2014年1月期间江苏省180名婴幼儿人群(6~<36月龄),主动监测CVA16-HFMD,分别采集0 d、2个月、8个月和24个月的系列血样,并检测其CVA16中和抗体。结果该人群在随访93.9~141 d期间发生了1起CVA16流行,共报告10例CVA16引起的HFMD。中和抗体结果显示,在CVA16流行前(2个月)CVA16中和抗体阴性的153例中,共有10例确诊为CVA16-HFMD(6.5%),49例在流行后(8个月)出现中和抗体阳转(阳转率为32.0%)。而在流行前CVA16中和抗体阳性的27例中,无1例患CVA16-HFMD,8例流行后呈中和抗体4倍及以上升高,占31.7%。10例CVA16-HFMD患者在流行后中和抗体均出现明显升高,较流行前平均升高51.71倍。结论婴幼儿人群中的CVA16中和抗体,可预防CVA16感染导致的HFMD。

体内电穿孔对载体表达效率和人类免疫缺陷病毒1型DNA疫苗免疫反应效果的研究

本文旨在分析体内电穿孔(EP)技术对DNA载体pDRVI1.0表达效率和人类免疫缺陷病毒1型(HIV-1)DNA疫苗免疫反应的辅助效果,为其在DNA疫苗中的应用提供参考数据。通过构建携带荧光素酶基因的pDRVI1.0-Fluc质粒,利用活体成像技术分析EP接种对荧光素酶蛋白的组织分布、表达水平和持续时间的影响;同时,构建携带我国HIV-1CRF07_BC流行毒株env基因的DNA疫苗pDRVI1.0-HIV,利用酶联免疫斑点法(ELISPOT)、酶联免疫吸附试验(ELISA)和中和抗体法对EP辅助免疫反应的特点进行分析。结果显示,EP接种后,pDRVI1.0-Fluc质粒未改变组织分布特点,但其体内表达效率显著提高,载体的饱和接种量降低。同时,EP技术提高了pDRVI1.0-HIV疫苗免疫小鼠后诱导的γ干扰素(IFN-γ)分泌型T细胞反应和Env特异性结合抗体效价。结果提示,EP技术可在DNA疫苗应用方面发挥作用。

抗CD19单抗的质量控制研究

目的:研究并建立针对抗白细胞分化抗原19(Cluster of Differentiation 19,CD19)单抗的关键质量属性质控方法。方法:运用肽图对抗CD19的单抗进行鉴别;采用还原/非还原十二烷基磺酸钠毛细管电泳(Capillary Electrophoresis-sodium Dodecyl sulfonate,CE-SDS)和分子排阻色谱(Size ExclusionHigh Performance Liquidchromatography,SEC-HPLC)进行单抗纯度的控制;运用成像毛细管等电聚焦电泳(Imaging Capillary Isoelectricfocusing Electrophoresis,iCIEF)测定电荷异质性;运用高效液相色谱法(High Performance Liquid Chromatography,HPLC)分析抗CD19单抗的糖基化,采用基于报告基因的抗体依赖的细胞介导的细胞毒效应(Antibody-Dependent Cell-mediated Cytotoxicity,ADCC)测定生物学活性。其他各项指标均应符合现行版《中华人民共和国药典》以及其他相关要求。结果:肽图检测抗CD19单抗具有相应的特征图谱,能够用于鉴别;还原CE-SDS的轻链与重链峰面积之和百分比为(98.77±0.05)%;非还原CE-SDS主峰峰面积百分比为(96.19±0.05)%,片段百分比为(3.81±0.05)%;SEC-HPLC单体的峰面积百分比为(99.42±0.001)%,聚合物峰面积百分比为(0.54±0.001)%;iCIEF分析的主要亚型的峰面积百分比为(66.41±0.38)%,酸性亚型的峰面积百分比为(13.69±0.16)%,碱性亚型的峰面积百分比为(19.90±0.46)%;在糖型分析中,占比最高的三个糖型分别为G0、G0-GN和M5,G0的含量为(64.64±0.61)%,G0-GN的含量为(9.75±0.42)%,M5含量为(6.22±0.35)%,生物学活性的半数最大效应浓度(Concentration for 50%of Maximal Effect,EC50)值为(10.09±1.40)ng·mL-1。结论:针对抗CD19单抗的关键质量属性,研究并建立了相应的质量控制方法,以确保其安全、有效和质量可控,为该类单抗产品的质量控制方法和策略提供参考依据。

复制型天坛株痘苗病毒在免疫缺陷型大鼠体内的生物分布特点及其对组织病理变化的影响

目的研究复制型天坛株痘苗病毒(r TV)在免疫缺陷型Rag2基因敲除(Rag2-/-)大鼠体内的生物分布特点及其对组织病理变化的影响,为复制型痘苗病毒载体疫苗的应用和安全性评价提供参考。方法 r TV分别以尾静脉注射途径感染免疫缺陷型Rag2-/-大鼠和野生型SD大鼠,以背部皮下注射途径感染免疫缺陷型Rag2-/-大鼠。利用Taq Man探针法实时荧光定量PCR检测痘苗病毒在大鼠体内的生物分布和病毒载量,比较分析两种模式动物Rag2-/-大鼠和SD大鼠感染r TV后的生物分布特点及r TV以不同途径感染Rag2-/-大鼠后的生物分布特点,并对感染过r TV的所有组织样本进行HE染色,比较分析不同分组大鼠感染r TV后的组织病理变化。结果与SD大鼠相比,r TV在免疫缺陷型Rag2-/-大鼠的生物分布范围更广;在免疫缺陷型Rag2-/-大鼠中,r TV尾静脉注射感染途径的效果要强于皮下注射的感染途径;r TV尾静脉注射途径感染Rag2-/-大鼠的心、睾丸和后爪的病毒载量显著高于尾静脉注射途径感染SD大鼠(P<0.001)和皮下注射途径感染Rag2-/-大鼠(P<0.001);与SD大鼠和皮下感染途径相比,通过尾静脉途径感染免疫缺陷型Rag2-/-大鼠的组织病理变化较明显,且均无由r TV引起的病理性损伤。结论复制型天坛株痘苗病毒在免疫缺陷型Rag2-/-大鼠体内表现出较广的组织分布、较高的表达水平及非特异性的组织病理变化,为其作为免疫缺陷类型患者的载体疫苗的应用的安全性提供了新的依据。

3种中国仓鼠卵巢细胞蛋白残留量检测试剂盒的比较研究

目的比较市售3种中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary,CHO)宿主细胞蛋白(host cell protein,HCP)残留量ELISA检测试剂盒(货号:A、B、C)的检测效果。方法分别使用3种试剂盒检测不同CHO细胞株表达的治疗性单抗原液、提取CHOK1细胞培养上清蛋白和3种CHO-HCP检测试剂盒自带CHO-HCP标准品,评价3种试剂盒的检测效果。将3种试剂盒的包被板与酶标二抗系列组合后,检测标准品和提取的CHO-K1细胞培养上清蛋白分析产生差异的原因。结果单抗样品检测中,试剂盒A、B相对于试剂盒C的检测回收率约为1.89%和15.34%;CHO-K1细胞培养上清蛋白样品检测中,试剂盒A、B、C的回收率分别为:4.05%、21.52%和35.98%;试剂盒标准品互测中,3种试剂盒检测自身标准品的回收率均在(100±15)%内;试剂盒A检标准品B、C的平均回收率分别为1.28%和7.99%。试剂盒B检测标准品A、C的平均回收率分别为55.76%和25.08%。试剂盒C检测标准品A、B的平均回收率分别为266.65%和73.31%;通过包被板和酶标二抗的系列组合的检测结果推导:微孔板包被抗体对CHO-HCP的覆盖能力方面:A>C>B;二抗对HCP的覆盖能力方面:B>C>A。结论该企业生产的3种CHO-HCP检测试剂盒中检测效率由高到低依次为C>B>A。

利用活体成像技术对5型腺病毒在小鼠体内生物分布和表达的研究

目的研究5型腺病毒（Ad5）不同途径感染小鼠后体内代谢和组织分布特点，为Ad5载体疫苗的应用和改造提供参考。方法构建携带萤火虫荧光素酶基因的Ad5-Fluc病毒并利用活体成像技术分析其感染BALB／c小鼠后的蛋白表达和组织分布特点，以及与裸鼠的感染特点进行比较。结果Ad5-Fluc肌肉途径感染BALB／c小鼠后出现肝脾转移表达的特点，且肌肉途径表达周期最长（〉60d），表达水平最高（P〈0.01）。病毒感染裸鼠后分布特点与BALB／c小鼠一致但表达周期明显延长。另外，用Ad35的纤突蛋白替代Ad5的纤突蛋白后的5型腺病毒载体（Ad5F35）在保持相似表达效率的同时消除了肝嗜性的特点。结论肌肉途径可能为5型腺病毒载体疫苗理想的免疫方式，同时Ad5F35病毒是一种理想的替代性腺病毒疫苗载体。

单克隆抗体药物研发进展

目的:对单克隆抗体药物研发进展进行综述,为行业提供参考。方法:通过查阅文献和相关数据库,对经典的单克隆抗体药物,以及由此衍生的抗体偶联药物、双特异性抗体药物的研究进行汇总、梳理。结果与结论:自1986年第一个单克隆抗体药物上市以来,全球已有超过100种单抗药物获批上市。国内已获批的进口单抗药物达42个,国产单抗药物达31个。经过30多年的研究和发展,单抗药物以其高度特异性和疗效确切的特点,在肿瘤、自身免疫、代谢、病毒感染等疾病领域显示出独特的优势和广阔的应用前景。

痘苗病毒滴度测定用国家标准品的制备

目的制备病毒载体疫苗滴度测定用国家标准品。方法以鸡胚成纤维细胞制备痘苗病毒,经密度梯度超速离心纯化后,加入天花疫苗保护剂,分装冻存,分发至我国4个不同实验室,按照统一的结晶紫染色蚀斑法实验方案进行协作标定,每次实验稀释后取2个稀释度,每个稀释度设5个平行孔,计算各实验室检测结果的几何均数,对标准品中痘苗病毒滴度进行赋值。检测病毒标准品于不同温度下保存不同时间的稳定性,并对病毒标准品的各项质量指标进行检定。结果 4个实验室共测定44次,4个实验室间的检测结果差异无统计学意义(P>0.05),各实验室检测结果的几何平均数为3.05×106PFU/ml,95%CI为2.00×106～4.65×106PFU/ml,标准差为0.09,总变异系数1.41%。制备的痘苗病毒标准品于4℃可稳定放置10 d,37℃放置稳定性较差。制备的痘苗病毒标准品装量检查合格(1 ml/支);pH值为6.9;无菌试验合格;分装重量精密性为0.95%。结论制备的痘苗病毒标准品可作为痘病毒载体疫苗滴度测定用标准品。

曲妥珠和曲妥珠单抗美坦新衍生物对不同乳腺癌细胞系的生物学效应研究

目的研究曲妥珠和曲妥珠单抗美坦新衍生物(T-DM1)对BT-474和HCC1954两种乳腺癌细胞系的不同生物学效应。方法运用流式细胞术检测两种细胞系中人表皮生长因子受体2(HER2)表达水平;运用酶联免疫吸附测定法(ELISA)检测曲妥珠和曲妥珠单抗美坦新衍生物与人表皮生长因子受体2抗原的结合能力;运用细胞增殖抑制/杀伤法,检测曲妥珠和曲妥珠单抗美坦新衍生物对两种细胞系的剂量反应曲线。结果人表皮生长因子受体2在两种细胞系中表达水平均较高;曲妥珠和曲妥珠单抗美坦新衍生物与人表皮生长因子受体2抗原的结合能力相似;曲妥珠对BT474具有增殖抑制作用,但是对HCC1954无作用,曲妥珠单抗美坦新衍生物则对BT474和HCC1953均具有杀伤作用。结论在细胞学模型中,曲妥珠单抗美坦新衍生物可以对人表皮生长因子受体2高表达但是曲妥珠耐药的细胞系具有生物学效应。

利用活体成像术对痘苗病毒小鼠体内生物分布和表达的研究

目的研究复制型天坛株痘苗病毒(rTV)和非复制型天坛株痘苗病毒(NTV)不同途径感染小鼠后体内代谢和组织分布特点,为两种痘苗病毒载体疫苗的应用和改造提供参考。方法构建携带萤火虫荧光素酶基因的rTV-Fluc和NTV-Fluc病毒,利用活体成像技术对两种病毒感染BALB/c小鼠后的蛋白表达水平和持续时间特点进行比较分析,并对rTV-Fluc多针感染中的抗病毒反应及其在BALB/c小鼠和裸鼠体内的分布和代谢特点进行比较。结果 rTV-Fluc和NTV-Fluc病毒肌内和皮内途径感染BALB/c小鼠后局限分布于接种部位,且rTV-Fluc的表达水平显著性高于NTV-Fluc病毒(P=0.015);rTV-Fluc感染小鼠后诱导较高水平的中和抗体,并显著降低了肌内途径第2针感染后的蛋白表达水平(P<0.05);rTV-Fluc感染裸鼠后分布特点与BALB/c小鼠一致但表达周期明显延长(120d比10d)。结论两株痘苗病毒表现出局限的组织分布、较高的表达水平并诱导较强的免疫反应等特点,为预防性痘苗病毒载体疫苗的应用提供了参考数据。

定量PCR-Taqman探针法检测NS0宿主细胞残留DNA的方法学验证

目的NS0宿主细胞残留DNA检测(定量PCR-Taqman探针法)方法的验证。方法针对小鼠骨髓瘤细胞(NS0)基因组重复序列设计合成多对引物、探针,通过实验优选最佳的引物探针组合;应用所建立的前处理试剂盒(磁珠法)对供试品中宿主细胞残留DNA进行富集纯化;根据《国际人用药品注册技术协调会(ICH)》及《中国药典》通则9101的要求,应用所建立的NS0宿主细胞DNA残留检测试剂盒进行线性与范围、准确度、精密度、专属性、定量限的方法学验证。应用NS0细胞生产的单克隆抗体工艺中间品及原液,验证所建立试剂盒对实际生产样品的检测性能,并组织5个独立实验室进行协作标定。结果 NS0细胞DNA检测(Taqman法)正向引物序列:CCCCTTCAGCTCCTTGGGTA、反向引物序列:GCCTGGCAAATACAGAAGTGG、荧光探针序列:FAM-AGGGCCCCCAATGGAGGAGCT-TAMRA;NS0细胞DNA标准曲线在3 fg·μL^-1~300 pg·μL^-1内,线性良好(r2> 0. 99);对6个浓度梯度检测的准确度偏差均<15%;定量限为3 fg·μL^-1;内部参考品DNA标定结果为30μg·m L^-1;精密度良好(RSD≤30%);能特异性地检测NS0细胞DNA,对大肠杆菌DNA、人类基因组DNA(人肾上皮293T细胞)、CHO(中国仓鼠卵巢)细胞DNA无扩增反应。另外,对于生产工艺中间品及原液的检测回收率均在70%~130%,RSD均<15%。5个独立实验室间协标检测数据RSD均<30%。结论自主研发NS0宿主细胞DNA残留检测试剂盒(定量PCR-Taqman探针法)特异性强、灵敏度高、准确度好,能够满足NS0宿主DNA残留检测要求。

基于报告基因的抗IFNR1单抗生物学活性测定方法的建立

目的:建立抗Ⅰ型干扰素受体亚基1单抗(抗IFNR1单抗)的生物学活性检测方法。方法:利用HEK293-ISRE-Luc细胞系,通过荧光素酶检测系统(ONE-Glo?Luciferase Assay System),进行抗IFNR1单抗生物学活性检测,并对该方法进行精密度、准确度、专属性的验证。结果:抗IFNR1单抗在该方法中均存在量效关系,利用四参数方程拟合成4S型曲线,50%、75%、100%、125%及150%的加标样品相对效价(n=3)分别为(49.58±2.90)%(RSD=5.8%)、(76.27±5.12)%(RSD=6.7%)、(99.84±4.21)%(RSD=4.2%)、(123.08±2.58)%(RSD=2.1%)、(158.69±4.72)%(RSD=3.0%),RSD均小于10%;加样回收率分别为(99.16±5.81)%、(101.69±6.82)%、(99.84±4.21)%、(98.47±2.06)%和(105.80±3.14)%,RSD均小于10%;专属性良好。结论:建立的抗IFNR1单抗生物学活性检测方法,可作为抗IFNR1单抗生物学活性的常规检测方法。

抗体偶联药物研发进展

本文通过查阅文献和相关数据库,回顾抗体偶联药物的研究历程,并对抗体偶联药物的各个关键构成要素进行梳理。自2000年第一个抗体偶联药物上市以来,全球已有12种抗体偶联药物获批上市。国内已有2个进口、1个国产抗体偶联药物获批上市。本文总结了近年抗体偶联药物的研究发展情况,综述了抗体偶联药物的抗原位点、连接子、细胞毒性载荷、偶联方式等各个组成要素,旨在提供当前抗体偶联药物较全面的信息,以促进该类药物未来的发展。

铜绿假单胞菌注射液体外抗肿瘤生物活性检测方法的建立

目的建立铜绿假单胞菌注射液(Pseudomonas aeruginosa,PA-MSHA)体外抗肿瘤生物活性检测方法。方法将系列稀释的PA-MSHA在体外直接作用于人肝癌细胞BEL-7402,光学显微镜下观察细胞的生长状态;MTT比色法检测其对细胞增殖水平的影响;对10批PA-MSHA成品分别检测3次,以半数抑制浓度(IC50)为指标,计算批内和批间变异系数(CV),验证方法的精密性。结果随着PA-MSHA稀释度的降低,光镜下贴壁的BEL-7402细胞数量逐渐减少,细胞皱缩并破碎;MTT比色结果显示,随着PA-MSHA稀释度的降低,孔内颜色逐渐变浅,BEL-7402细胞增殖抑制率逐渐升高,呈一定的剂量-效应关系;10批PA-MSHA成品3次检测的IC50值范围为(3.584～7.778)×108个/ml,批内变异系数为4.58%～24.17%,批间变异系数15.08%～16.95%,总变异系数为15.81%,均符合细胞实验变异系数应小于30%的标准;PA-MSHA成品经该方法检测后,得到的IC50值在(3.109～7.383)×108个/ml范围内时,表明成品的生物活性合格。结论建立了PA-MSHA体外抗肿瘤生物活性检测方法,该方法稳定性好、精密性高,而且具有操作简便、节约成本和时间等优点,可用于对PA-MSHA以及其他类似细菌类生物制品的体外生物活性研究。

分子动力学模拟分析巴利昔冻干保护剂的活性保护机制

目的研究巴利昔单抗制剂中冻干保护剂蔗糖、甘氨酸、甘露醇的作用机制。方法使用Gromacs5.0.5工具包,在300K的体系条件下,运用计算机模拟的方法,搭建模型,分别模拟分析了天然状态、干燥状态和添加复合保护剂的状态下的巴利昔-Fab分子结构,从结构生物学的角度比较并分析冻干保护剂对巴利昔制剂的保护机制。结果干燥状态时,巴利昔分子的活性结构会有明显塌陷,无规则卷曲数目明显增多,分子间氢键数目减少,表面静电性质也会因此有所变化,而在蔗糖、甘氨酸和甘露醇复合保护剂存在的情况下,以上情况能明显得到改善,从而抑制巴利昔由于干燥失水而导致的结构塌缩和变性失活。结论蔗糖、甘氨酸和甘露醇复合保护剂的使用能很好地保护巴利昔冻干制剂的活性。

重组人生长激素水针剂生物活性测定方法改进

采用美国药典方法筛选合格的去脑垂体幼龄大鼠,并将胫骨染色法改为石蜡包埋、切片、苏木精-伊红(HE)染色,用于测定重组人生长激素(rhGH)水针剂的生物活性。结果表明,采用术后8～14 d内体重变化小于10%的标准筛选去脑垂体大鼠比中国药典法更合理,可避免大鼠体重不稳定而发生的误判;相比于中国药典2010年版收载的硝酸银染色法,胫骨HE染色法可操作性强,人为影响因素较少,切片可长期保存,染色后胫骨骨骺板即软骨带清晰可见,边界明确,胫骨骨骺板宽度易测量。与模型组相比,rhGH水针剂的各剂量组胫骨骨骺板宽度显著增宽(P<0.01),体重显著增加(P<0.01),且呈剂量相关性。本法及中国药典法测得rhGH水针剂的生物活性均大于2.5 IU/mg。