流感减毒活疫苗效力试验检测新方法的建立

目的建立基于NP蛋白检测的流感减毒活疫苗病毒滴度检测方法,并进行初步应用。方法对病毒接种方式、流感病毒感染MDCK细胞培养时间、一抗和酶标二抗的稀释度、封闭液等ELISA反应条件进行筛选优化。采用建立的方法检测3批流感减毒活疫苗原液和1批疫苗成品,并与鸡胚培养法检测结果进行比较。结果选择直接接种法作为接种方式,病毒感染细胞后培养48 h进行NP蛋白表达的检测; ELISA检测条件一抗稀释度为1∶4 000,酶标二抗稀释度为1∶4 000,2%牛血清白蛋白封闭2 h,检测结果 P/N值最大。用建立的方法检测流感减毒活疫苗原液及疫苗成品效力,与鸡胚培养法检测结果差异无统计学意义(P>0.05),具有较好的一致性。结论建立了基于NP蛋白检测的流感减毒活疫苗效力试验方法,可用于生产过程中流感减毒活疫苗原液和成品的检定。

人乳头瘤病毒假病毒中和试验血清起始稀释倍数的研究

目的对人乳头瘤病毒(human papilloma virus,HPV)假病毒中和试验起始稀释倍数进行研究,确定该系统中合适的起始稀释倍数。方法为了排除血清中HPV抗体以及母传抗体的干扰,选取50份15~18月龄的儿童血清作为验证样本。血清以不同的稀释倍数,与适量的假病毒中和。以光学显微镜观察接种细胞的形态,来判定不同稀释度的血清对细胞生长状况的影响;观察感染细胞表达的绿色荧光蛋白的强度及数量,以此考察血清对假病毒感染过程的影响。结果血清稀释度1∶40对细胞生长状况影响较小;该稀释倍数的病毒进入细胞表达的荧光强度与不加血清的阳性对照类似;假病毒感染细胞导致的荧光斑点数与真实病毒对照相比减少了10%,远低于中和试验判定阈值(相对抑制率50%)。结论在该实验系统中,HPV假病毒中和试验的血清起始稀释度以1∶40较为合适。

流感减毒活疫苗诱发黏膜IgA抗体间接ELISA检测方法的优化及其实验室内控品的制备

目的优化流感减毒活疫苗诱发黏膜IgA抗体的ELISA检测方法,并制备IgA抗体实验室内控品。方法采用ELISA检测法对流感病毒抗原(全病毒及其相应HA抗原)及包被浓度(0. 5、1、2、4μg/mL)、封闭液(1%BSA、10%FBS、5%脱脂奶粉)及封闭时间(1、1. 5、2 h)、样本稀释液(含1%BSA的PBST、含2%脱脂奶粉的PBST、样本保存液)及样本作用时间(45、60、75 min)、酶标抗体稀释度(1∶1 000、1∶2 000、1∶4 000、1∶8 000)进行优化。采用优化的方法制备针对H1N1、H3N2和B型3个型别流感病毒的IgA抗体检测用实验内控品,并用该方法对接种三价流感减毒活疫苗的20名志愿者的鼻咽拭子样本进行检测。结果最适间接ELISA法检测条件为:以全病毒作为包被抗原,包被浓度为1μg/mL;以含1%牛血清白蛋白为封闭液封闭2 h;样本稀释液为2%脱脂奶粉的PBST,作用时间为60 min;酶标抗体稀释度为1∶1 000。采用优化方法制备的H1N1、H3N2、B型IgA抗体阳性实验室内控品几何平均滴度分别为23、45、35,可接受范围分别为16~32、32~64、32~64。接种疫苗后20名志愿者中3种型别IgA抗体滴度较接种前均显著增高(P <0. 001),40%~50%志愿者接种后IgA抗体滴度比接种前至少升高2倍。结论成功优化了流感减毒活疫苗诱发黏膜IgA抗体的ELISA检测方法,制备的IgA抗体的实验室内控品可用于流感减毒活疫苗接种后鼻咽拭子抗体的检测。

呼吸道合胞病毒滴度间接免疫荧光检测方法的建立及验证

目的建立呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)滴度的间接免疫荧光检测方法,并进行验证。方法以Synagis(Palivizumab)为一抗,荧光标记羊抗人IgG为二抗,建立用于RSV滴度检测的间接免疫荧光法,并对HEp-2细胞接种密度(3×104、4×104、5×104、6×104、7×104、8×104个/孔)、细胞培养液中胎牛血清浓度(2.5%、5%、10%、20%)、病毒培养时间(20、24、26、30、38、48 h)、抗体稀释度[一抗:1∶(1000/3)、1∶1000、1∶3000、1∶9000,二抗:1∶(400/3)、1∶400、1∶1200]进行优化。验证方法的特异性、线性范围、准确性、重复性。结果建立的方法最佳工作条件:HEp-2细胞接种密度为6×104个/孔,胎牛血清浓度为2.5%,病毒培养时间为24~26 h,一抗稀释度为1∶1000,二抗稀释度为1∶400。RSV可见特异性荧光,狂犬病病毒、流感病毒、风疹病毒均未见荧光;RSV滴度理论值在1.70×107~5.43×103 FFU/mL范围内,与检测值呈良好的线性关系,回归方程为y=1.0313 x-0.2508,R2=0.9897;准确性验证回收率在70%~130%范围内;重复性验证RSD均≤15%。结论建立的RSV滴度间接免疫荧光检测方法具有良好的特异性、准确性、重复性,且检测周期短,可用于RSV滴度快速检测。

流感减毒活疫苗诱导的粘膜反应IgA抗体检测方法的可行性分析

目的:对建立的检测流感病毒特异性IgA抗体检测方法进行验证,并且用于评价流感减毒活疫苗(LAIV)粘膜免疫反应。方法:使用来自英国生物制品所(NIBSC)的流感抗原国际参考品作为包被抗原,检测鼻咽拭子阳性样品,确定流感病毒型别特异性的IgA抗体滴度,考察该方法的特异性;通过对高低不同抗体滴度的阳性样本多次平行检测来评价该方法的重复性;在此基础上,对526份鼻咽拭子样本进行IgA抗体滴度检测。结果:只针对包被抗原阳性的样品检测到高滴度的IgA抗体,其他型别的抗体未检测到,方法特异性显著。鼻咽拭子IgA抗体检测方法的组间重复性、组内重复性、方法重复性良好。检测接种LAIV疫苗免疫前后的鼻咽拭子样本,疫苗组H1N1、H3N2以及B型IgA抗体几何平均滴度(GMT)接种前后的比值分别为1.15、1.45和1.18,均高于安慰剂组;疫苗接种组IgA抗体滴度高于免疫前2倍的比率,也高于安慰剂对照组(P<0.05)。鼻咽拭子IgA抗体检测结果与血清样本HI抗体结果缺乏相关性(P<0.001)。结论:建立的流感病毒特异性IgA抗体的检测方法能够满足LAIV粘膜免疫评价的需要。

人甲型H7N9禽流感全病毒灭活疫苗和裂解疫苗在小鼠中的免疫原性研究

目的比较人甲型H7N9禽流感全病毒灭活疫苗和裂解疫苗在小鼠中的免疫原性，为该疫苗的类型选择提供初步依据。方法采用相同血凝素含量（5μg）的H7N9全病毒灭活和裂解疫苗（含或不含氢氧化铝佐剂共4种类型），分别对BALB／c小鼠进行1针或2针免疫。免疫后，用血凝抑制（hemagglutination inhibition，HI）试验检测血清抗体滴度，比较不同类型疫苗的免疫效果。结果小鼠免疫1针全病毒灭活疫苗后，全部血清阳转，HI抗体几何平均滴度（geometricmeantiter，GMT）为149；免疫2针后，抗体GMT为243。小鼠免疫1针裂解疫苗后无抗体阳转；免疫2针后全部抗体阳转，GMT为139。两种疫苗添加铝佐剂后，诱导的HI抗体GMT仅略有增加。结论H7N9全病毒灭活疫苗在小鼠中的免疫原性较强。在同样类型和剂量的情况下，裂解疫苗需要免疫两次才能达到与全病毒疫苗相同的效果。铝佐剂对免疫原性提升不明显。

人类乳头瘤病毒特异性抗体单一稀释度ELISA检测方法的建立、验证及初步应用

目的建立人类乳头瘤病毒(human papillomaviruses,HPV)特异性抗体单一稀释度ELISA检测法,并进行方法验证及初步应用。方法以HPV16及HPV18 L1病毒样颗粒蛋白作为包被抗原,血清样品采用单一稀释度稀释(未免疫血清及免疫后血清分别进行100及500倍稀释),建立HPV特异性抗体的单一稀释度ELISA检测法,并验证方法的特异性、准确性、线性范围、检测限度及精密性。采用建立的方法检测自然感染HPV及接种疫苗后的血清样本(各28份),并与假病毒中和试验(pseudovirus-based neutralization assay,PBNA)检测结果进行比较。结果 100份阴性血清样本HPV16及HPV18 IgG抗体均为阴性;HPV16及HPV18抗体滴度的平均回收率分别为74%和73%;HPV16及HPV18抗体的定量检测范围分别为0. 049~0. 370 IU/mL及0. 030~0. 231 IU/mL;该方法重复性CV在2. 9%~6. 6%之间,日间精密性CV在7. 7%~11. 9%之间。接种疫苗后的血清样本检测值显著高于自然感染样本(P <0. 05),接种疫苗后的血清样本检测值与PBNA法检测结果具有显著相关性(HPV16和HPV18抗体检测结果的r值分别为0. 727和0. 800)。结论成功建立了HPV特异性抗体的单一稀释度ELISA检测法,且具有较好的特异性、准确性、精密性,可用于HPV疫苗免疫效果评价及疫苗上市后抗体水平的监测。

细胞基质流行性感冒疫苗及其生产方式的研究进展

流行性感冒病毒(简称流感病毒)引起的流行性感冒(简称流感)是世界最大的公共卫生挑战之一。WHO建议每年接种流感疫苗,这是预防流感的最有效方法。流感疫苗生产一般通过鸡胚生产,但无法在大流行时满足需求,现新型流感疫苗均在研究利用合成培养基,通过微载体及悬浮培养进行流感疫苗生产,可在短时间内生产出有效的疫苗,作为鸡胚流感疫苗的补充。本文就目前细胞基质流感疫苗及其生产方式的研究进展作一综述。

B型流感病毒血凝素的纯化

目的纯化B型流感病毒血凝素（hemagglutinin，HA）。方法使用不同浓度的菠萝蛋白酶酶切B型流感病毒HA，超速离心获得含HA的上清后，经蔗糖密度梯度离心进行纯化，HPLC分子筛分析纯化效果。纯化后的蛋白经糖苷酶PNGaseF处理后，切取丰度较高的蛋白条带，进行质谱鉴定。结果病毒蛋白与菠萝蛋白酶蛋白含量的最佳比例为40：1；5％-30％梯度浓度的蔗糖能很好地去除低相对分子质量的蛋白，流感病毒内丰度较高的NP及M蛋白得到很好的去除；纯化的HA蛋白的纯度大于90％，且HPLC分析显示仅有1个主峰，均一性良好。结论优化了B型流感病毒HA蔗糖密度梯度离心纯化方法，获得了高纯度的HA蛋白，为制备HA标准抗血清奠定了基础。