鼠疫耶尔森菌F1抗体检测试剂国家参考品的研制

为研制鼠疫耶尔森菌F1抗体检测试剂国家参考品,本研究制备了6份F1抗体阳性参考品、8份F1抗体阴性参考品、1份最低检出限参考品和1份重复性参考品,组成了鼠疫耶尔森菌F1抗体检测试剂国家参考品。对参考品进行均匀性检查及稳定性评估,并组织4家实验室进行协作标定。结果显示,参考品均匀性及稳定性良好。协作标定结果显示,6份阳性参考品阳性率均为100%;8份阴性参考品阴性率均为100%;最低检出限参考品的检出水平介于1~100倍稀释度;重复性参考品检测结果一致(其中酶联免疫法及上转发光法试剂检测结果的变异系数均小于15%)。结果表明,本研究建立的鼠疫耶尔森菌F1抗体检测试剂国家参考品基本符合体外诊断试剂参考品的要求,可用于相关试剂的质量评价。

鼠疫耶尔森菌基因分型国家参考品研制

鼠疫是由鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis)(简称鼠疫菌)引起的一种自然疫源性疾病,以发病急、传播快、病死率高为特征,对人类社会影响巨大。鼠疫主要在啮齿类动物中引起原发性感染,病原菌经鼠蚤传播给人,其引起的疾病主要包括腺鼠疫、肺鼠疫和败血型鼠疫3种类型。其中肺鼠疫发病迅猛,可通过空气在人间传播,病死率极高[1]。人类历史上曾发生过三次鼠疫大流行,造成上亿人死亡。时至今日,很多地区,如非洲、亚洲、美洲,仍将鼠疫视为可能会死灰复燃的烈性传染性疾病之一[2-4]。

重组腺相关病毒感染细胞后目的蛋白表达水平检测方法的建立及验证

目的建立重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus,rAAV)感染细胞后目的蛋白表达水平的检测方法,并进行方法验证,以期用于rAAV9生产过程中不同阶段产物的质量监控。方法将rAAV9供试品用感染增强剂Envirus-AAV处理后,感染经羟基脲(hydroxyurea,HU)作用的人脑星形胶质母细胞瘤细胞U87-MG,以rAAV9参考品为标准,采用ELISA法检测细胞中目的蛋白戊二酰辅酶A脱氢酶(glutaryl-CoA dehydrogenase,GCDH)的表达水平,并验证方法的专属性、准确性、精密性、线性范围、定量限及耐用性。采用建立的方法检测8批rAAV9供试品。结果供试品缓冲液的A_(450)-A_(630)为0.3,略低于蛋白定量四参数标准曲线最低稀释点(1 ng/mL);150%、100%、50%理论相对效价水平样品平均回收率均在100.0%~107.3%范围内;同1名实验员重复3次及不同实验员检测3个理论相对效价水平样品的目的蛋白表达水平RSD均<25%;rAAV9供试品在50%~150%理论相对效价水平范围内,与相应的目的蛋白表达水平呈良好的线性关系,直线回归方程为y=1.077 x-0.022,R~2为0.984;方法的定量限为0.59,即6.0×10^(12)vg/mL;U87-MG细胞用HU孵育不同时间(18、21、24 h)、细胞培养上清液于不同条件(室温放置0.5 h、-60℃以下放置12 h、-60℃以下放置24 h)保存后,目的蛋白表达水平RSD均<25%。1~8批rAAV9供试品目的蛋白表达水平分别为111%、121%、72%、65%、86%、75%、102%、91%。结论建立的rAAV感染细胞后目的蛋白表达水平检测方法具有良好的专属性、准确性、精密性及耐用性,可用于rAAV9生产过程中不同阶段产物的质量监控。

腺相关病毒基因治疗产品基因组滴度数字PCR检测方法的建立及验证

目的建立一种广泛用于腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)基因治疗产品基因组滴度检测的数字PCR(digital polymerase chain reaction,dPCR)法,并进行初步验证。方法通过对同一批次AAV基因治疗产品进行dPCR检测,优化筛选最佳引物、探针、样品处理方式以及引物、探针浓度;对优化后方法进行专属性、线性、相对准确度、重复性验证,并确定方法的定量限及检测范围。结果选择NFS-05 vector titer 5.0为引物、探针,引物终浓度为800 nmol/L,探针终浓度为400 nmol/L,样品前处理方式为经Proteinase K消化。建立的方法专属性良好;在3.3×10~5~1.3×10~8vg/mL检测范围内,标准曲线相关系数(R~2)>0.999;相对准确度为70%~130%;重复性CV均≤15%;定量限为3.3×10~5vg/mL。结论建立的dPCR法专属性、线性、准确度及重复性良好,可用于NFS-05重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus,rAAV)原液产品基因组滴度的检测。

鼠疫耶尔森菌核酸检测试剂国家参考品的研制

目的研制鼠疫耶尔森菌(以下简称鼠疫菌)核酸检测试剂国家参考品,以期用于鼠疫菌核酸检测试剂的评价和质量控制。方法选择5株鼠疫菌[EV株、0614F株、otten株、Tjiusidej(R)株、田鼠型201株]和10株阴性菌(3株小肠结肠炎耶尔森菌、牛种布鲁菌104M株、炭疽芽孢杆菌、伤寒沙门菌、土拉热弗朗西丝菌LVS株、假结核耶尔森菌、霍乱弧菌和志贺菌),经培养、收获、灭活,获得参考品原液,进行普通PCR扩增法验证后,制备成1套由5支阳性参考品、10支阴性参考品、1支最低检出限参考品(EV株阳性参考品经冻干制备而成)和1支重复性参考品(制备方法同最低检出限参考品)组成的国家参考品。采用荧光定量PCR法检测国家参考品的阴阳性符合率、均匀性和稳定性,并组织4家单位进行协作验证。结果阳性参考品原液经普通PCR扩增,均可见相应目的基因条带;阴性参考品原液未扩增出相应基因条带。荧光定量PCR法检测国家参考品阴阳性符合率均为100%。重复3次检测10支最低检出限参考品的3a基因Ct值差异无统计学意义(F=1.567,P=0.193)。与未经冻融的参考品比较,反复冻融3次的最低检出限参考品及阳性参考品3a基因Ct值差异无统计学意义(t分别为0.416和0.079,P均>0.05)。与未经高温保存的参考品比较,37℃放置5 d的最低检出限参考品Ct值差异有统计学意义(t=7.109,P=0.002),4和25℃条件下差异无统计学意义(t分别为0.341和0.751,P均>0.05);4、25、37℃放置5 d的阳性参考品Ct值差异均无统计学意义(t分别为2.442、0.373和-0.043,P均>0.05)。4家单位检测阳性和阴性参考品的符合率均为100%;2家单位检测最低检出限参考品的最低检出限为1×10^(2)个/mL,另2家为1×10^(3)个/mL;4家单位对重复性参考品检测结果的CV值<10.0%。结论本研究研制的鼠疫菌核酸检测试剂国家参考品具有良好的均匀性和冻融稳定性,于4和25℃下放置具有良好的加速稳定性,可用于鼠疫菌核酸检测试剂的评价和质量控制。

铅黄肠球菌CMCC(B)32220的鉴定和全基因组分析

目的应用多种方法对CMCC(B)32220鉴定和分析,了解其全基因组的分子特征。方法将待鉴定菌株CMCC(B)32220复苏培养后,依次进行形态学、全自动生化鉴定、基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)分析、16S rRNA基因以及全基因序列测定,应用生物信息学方法分析其基因组基本特征,并预测基因功能、耐药性及致病性。结果经全自动生化和MALDI-TOF-MS鉴定分析菌株CMCC(B)32220均为铅黄肠球菌。CMCC(B)32220菌株与NCBI数据库中已发表2株代表性铅黄肠球菌16S rRNA基因序列相似度分别为99.4%和98.9%,而与不同肠球菌16S rRNA基因序列相似度为94.8%~98.7%。CMCC(B)32220染色体全基因组序列全长为3195952 bp,包含3054个基因,其中具有直系同源簇(COG)功能2453个,参与KEGG代谢通路1622个。而基于全基因组水平的平均核苷酸一致性(ANI)分析证实CMCC(B)32220菌株与已发表的铅黄肠球菌的ANI值为95.1%,而与其他3株肠球菌属不同种(屎肠球菌、鸡肠球菌和粪肠球菌)代表性菌株基因组的ANI值均小于80%。预测蛋白质同源性分析表明其基因组中编码2772个(占93.7%)铅黄肠球菌特异性蛋白质。其基因组仅含2种耐药基因,并存在5种对人潜在致病性相关蛋白质。结论应用多种不同原理方法成功系统鉴定CMCC(B)32220符合铅黄肠球菌特征,并获得其全基因组的基本特征资料,为细菌标准菌株提供更多背景数据。

无细胞百日咳疫苗抗体活性持久性监管研究

目的:比较不同类型无细胞百日咳疫苗免疫小鼠后诱导的抗体应答及其持久性。方法:将来自于3家企业,采用2种不同工艺生产的无细胞百日咳疫苗(组分苗和共纯化苗)按一定比例稀释后分别给3组小鼠皮下接种,0.5 mL/只,于第4周加强免疫,剂量与初免疫相同。于免疫后第4周、第5周、第8周、第12周、第17周、第30周、第40周、第50周和第65周取血,分离血清,检测小鼠血清中抗百日咳抗体IgG水平(抗-PT和抗-FHA)和PT的中和抗体水平,并对其结果进行分析比较。结果:两类疫苗组检测结果比较,在免疫后第30周之前,两组之间抗-PT和抗-FHA水平无显著性差异;但在30周之后,两组之间抗-PT和抗-FHA水平有显著性差异(P <0.05),组分苗组抗体水平高于共纯化苗组。中和抗体方面,组分苗组中和抗体水平高于共纯化苗组,两组比较有显著性差异(P <0.05)。结论:两种类型的百日咳疫苗免疫小鼠后均能诱导产生体液免疫应答,组分苗组的抗体持久性(包括百日咳抗体IgG和百日咳PT中和抗体)强于共纯化苗组;且百日咳IgG抗体与中和抗体之间具有一定的相关性。

鼠疫耶尔森菌F1抗原检测试剂国家参考品的研制

目的 研制鼠疫耶尔森菌F1抗原检测试剂国家参考品。方法 选取5株表达F1抗原的鼠疫耶尔森菌和10株非鼠疫耶尔森菌的菌种,组建了阳性参考品和阴性参考品。经分装冻干鼠疫耶尔森菌F1抗原,组建了最低检出限参考品和重复性参考品。经4家实验室共使用5种鼠疫耶尔森菌(F1)抗原检测试剂盒进行协作标定,评价参考品的均匀性和稳定性。结果 本套参考品的均匀性和稳定性良好。协作标定结果显示:①阳性参考品及阴性参考品的符合率均为100%;②最低检出限参考品的检出限在10~100 ng/mL之间;③重复性参考品检测反应结果应一致(酶联免疫法、上转发光免疫层析法等CV<15%)。结论 本套参考品基本符合国家关于体外诊断试剂的参考品设计要求,可用于评价相关试剂。

Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗D抗原含量检测方法的建立

目的 建立检测Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗中D抗原含量的双抗体夹心ELISA方法。方法 采用纯化的D抗原制备鼠单抗和牛多抗,采用微量中和病变和间接ELISA检测抗体的效价与特异性。以牛多抗为包被抗体、小鼠单抗为显示抗体建立夹心ELISA检测D抗原含量的方法,并进行方法学验证。结果 制备了高效价的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型牛多抗和鼠单抗,牛多抗微量中和效价分别为409 600、96 000和128 000,鼠单抗微量中和效价分别为256 000,128 000和256 000,并可与相应型别D抗原特异性结合。采用这些抗体成功建立了夹心ELISA方法,3个型别标准曲线线性良好,R^(2)>0.99。对所建立的方法进行验证,其结果显示,Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型加标回收率分别为80.4%~117.7%、90.3%~111.6%、91.9%~111.3%,均在80%~120%范围内;实验内与实验间CV均<10%;并且能够有效区分D抗原与C抗原。采用国内5家企业生产的疫苗进行了适用性验证,结果显示方法适用性良好。结论 成功建立了检测Sabin株脊髓灰质炎灭活疫苗中D抗原含量的双抗体夹心ELISA方法,该方法具有良好的准确性与精密度,特异性强,并且能够检测不同企业生产的疫苗。

以CD79b为靶点抗体偶联药物的质量研究

目的:建立抗体偶联药物(ADC)抗CD79b单抗-vc-MMAE(维泊妥珠单抗)的质控方法。方法:采用细胞杀伤法测定抗CD79b单抗-vc-MMAE的生物学活性;采用表面等离子共振法(SPR)测定其亲和力参数(K_(D));采用酶联免疫吸附测定法(ELISA)测定其与CD79b的相对效价;对抗CD79b单抗及抗CD79b单抗-vc-MMAE进行肽图鉴别;采用分子排阻色谱法(SEC-HPLC)和十二烷基硫酸钠毛细管电泳法(CE-SDS)分析其纯度;采用毛细管等点聚焦电泳法(iCIEF)分析其电荷异质性;采用液质联用法(UPLC-MS)测定其相对分子质量和药物抗体偶联比(DAR);采用疏水色谱法(HIC-HPLC)进一步确认其DAR;采用反相色谱法(RP-HPLC)测定游离小分子药物。结果:抗CD79b单抗-vc-MMAE的生物学活性相对效价为(99.32±3.99)%,K_(D)为(4.27±0.27)×10^(-9)mol·L^(-1),结合活性相对效价为(106.01±2.88)%,抗CD79b单抗和抗CD79b单抗-vc-MMAE的参比品与其样品的肽图图谱一致,SEC-HPLC主峰纯度为(99.32±0.05)%,非还原CE-SDS的重链-重链-轻链-轻链(HHLLC)纯度为(6.89±0.19)%,重链-重链-轻链(HHLC)纯度为(27.21±0.15)%,重链-重链(HHC)纯度为(18.33±0.06)%等,还原CE-SDS轻链和重链纯度为(95.47±0.16)%,iCIEF主峰峰面积百分比为(73.57±0.55)%,主峰等电点7.53±0.00,液质联用法测定抗CD79b单抗-vc-MMAE分别偶联0、2、4、6个小分子药物的相对分子质量为147891、150527、153161和155796,DAR为3.60,HIC法测得的DAR为3.53±0.01,RP-HPLC测定游离小分子药物浓度为(0.039±0.003)μg·mL^(-1)。结论:建立了抗CD79b单抗-vc-MMAE的质控方法,对该产品的安全性、有效性进行控制,为该类ADC药物的质量检测提供参考。

腐生性钩端螺旋体Potoc菌株全基因组学分析

目的 了解腐生性钩端螺旋体(简称钩体)Potoc菌株的全基因组分子特征。方法 将腐生性钩体Potoc菌株培养后,应用高通量测序技术进行全基因组序列测定和比较基因组学分析,并将Potoc菌株灭活菌液与国内15种不同血清群致病性钩体代表菌株的兔血清进行免疫印迹分析。结果 腐生性钩体Potoc菌株全基因组序列全长为3 942 789 bp,共含有编码基因3685个,其中具有直系同源簇功能2052个,其平均GC含量为39.0%。比较基因组学分析发现Potoc菌株与国外已发表的腐生性钩体Ames菌株基因组核苷酸一致性高,同时也证实其基因组中并不存在O抗原生物合成基因簇(rfb)序列或类似基因。与问号基因种、波氏基因种和中间型L.licerasiae菌株存在共有基因1110个,而Potoc菌株基因组中所含有特有的基因共计2278个。免疫印迹分析结果发现Potoc菌株与致病性钩体中存在种属特异性的蛋白抗原成分。此外,基于全基因组水平的系统发育进化树显示,不同致病性钩体分为不同进化分支,具有特定进化历程。结论 获得了腐生性钩体Potoc菌株基因组的基本特征,探究了钩体属特异性抗原,揭示了不同基因种钩体基因组多样性,为后续致病性钩体的诊断和进化等研究奠定一定基础。

原型株及变异株SARS-CoV-2灭活疫苗在大鼠体内的免疫原性评价

目的评价原型株、Beta株、Gamma株和Delta株SARS-CoV-2灭活疫苗在大鼠体内的免疫原性。方法分别将原型株、Beta株、Gamma株和Delta株SARS-CoV-2灭活疫苗经大腿肌内免疫5只雌性Wistar大鼠2次,间隔14 d,免疫剂量均为3μg病毒蛋白/(0.5 mL·只),初次免疫后14、28和42 d,经静脉采集血,分离血清。间接ELISA法检测血清IgG抗体水平;微量中和试验检测血清中和抗体效价;计算血清中和抗体效价的抗原比,以评价2株病毒间的抗原性差异。结果初次免疫后14 d,全部免疫血清中均可检测到针对4株病毒的IgG抗体,28 d的IgG抗体水平较14 d提高10倍以上,42 d时效价略有下降。首次免疫后14 d,免疫原型株或Delta株疫苗的大鼠血清中,针对4株病毒的中和抗体全部阳转;免疫Beta株和Gamma株疫苗的大鼠血清中,针对Beta株和Gamma株病毒的中和抗体全部阳转,针对原型株或Delta株病毒的中和抗体部分阳转。初次免疫后28 d,4种病毒免疫血清中和抗体均阳转,中和抗体效价较14 d大幅升高;初次免疫42 d时中和抗体效价较28 d总体略有下降。Beta株与Gamma株间、原型株与Gamma株间抗原性差异较小,原型株与Beta株间抗原性差异较大。结论原型株、Beta株、Gamma株和Delta株SARSCoV-2灭活疫苗均能刺激大鼠产生较高效价的中和抗体,但免疫原性有差异。

重组腺相关病毒装载目的核酸完整性分析

目的探讨重组腺相关病毒(recombinant adeno-associated virus,rAAV)装载目的核酸完整性检测方法,并初步建立分析算法。方法消化rAAV外游离DNA片段,提取病毒基因组,设计5对搭接引物,采用正交排列方式,分别用数字PCR仪进行检测,常规条件采用EveGreen和模板4μL的20μL反应体系,数字PCR条件:95℃5 min;95℃15 s,55℃30 s,72℃90 s,45个循环。超长核酸片段增强条件采用Mix B-2000 bp和模板2μL的25μL反应体系,采用仪器附带软件定量。最小二乘法拟合分析共有的全长片段数量,进而解读目的核酸完整性分布情况。结果引物间距离不大于1200 nt的片段可得到有效扩增,经系统分析得到一系列片段长约1000 nt的有效片段拷贝数,最小二乘法拟合分析共有片段拷贝数量,估计样本中全长片段不多于1234 copies/μL,该值与测得的最大值(1443 copies/μL)之间差异有统计学意义(P<0.05),差异占比约16.9%。结论初步建立了rAAV装载目的核酸完整性的检测方法,并分析出供试品中存在一定数量的不完整目的核酸,为后续深入研究奠定了基础。

b型流感嗜血杆菌结合疫苗游离多糖含量检测高效阴离子交换色谱-脉冲安培法的建立及验证

目的建立b型流感嗜血杆菌(Haemophilus influenzae type b,Hib)结合疫苗游离多糖含量检测的超速离心联合高效阴离子交换色谱-脉冲安培(high performance anion exchange chromatography with pulsed amperometric detector,HPAEC-PAD)法,并对该方法进行验证及初步应用。方法将供试品经超速离心后,收集上清获得游离多糖,加入水解液使供试品水解约16 h后,采用CarboPacPA-104 mm×250 mm分析柱与CarboPacPA-104 mm×50 mm保护柱,氢氧化钠-醋酸钠溶液梯度洗脱,检测供试品游离多糖含量。对该方法进行专属性、线性、精密度、稳定性、准确度验证,确定定量限。用建立的方法检测13个批次Hib结合疫苗游离多糖含量,同时与乙醇沉淀法进行比较。结果Hib多糖标准品在0.77~12.26μg/mL范围内,与峰面积呈良好的线性关系,测定5次,线性相关系数均大于0.995;方法定量限为1.875 ng/mL;精密度、稳定性的RSD均小于5%;高、中、低3个浓度的平均加标回收率为100.26%,RSD为3.96%。13个批次Hib结合疫苗中的游离多糖含量为6.76%~16.74%。结论该方法准确可靠,可用于检测Hib结合疫苗游离多糖含量,同时也为其他多糖蛋白结合疫苗游离多糖提取和检测提供了思路。

以CD79b为靶点抗体偶联药物结合活性的评价研究

目的:建立抗CD79b单抗及抗CD79b单抗-vc-MMAE的表面等离子共振(surface plasmon resonance,SPR)法和酶联免疫吸附测定(enzyme linked immunosorbent assay,ELISA)法评价其结合活性。方法:采用SPR法,使用Protein A芯片,测定抗CD79b单抗及抗CD79b单抗-vc-MMAE与其靶点CD79b蛋白之间的动力学常数包括结合常数(K_(a))和解离常数(K_(d))、亲和力常数(K_(D))、半最大效应浓度(half maximal effective concentration,EC_(50))及相对效价;采用经典ELISA法测定抗CD79b单抗及抗CD79b单抗-vc-MMAE与CD79b的EC_(50)及相对效价。结果:经3次实验测定,抗CD79b单抗与CD79b的K_(a)为(2.61±0.14)×10^(6)L·mol^(-1)·s^(-1),K_(d)为(1.87±0.12)×10^(-2)s^(-1),K_(D)为(7.17±0.30)×10^(-9)mol·L^(-1),RSD均<10%;抗CD79b单抗-vc-MMAE与CD79b的K_(a)为(2.99±0.26)×10^(6)L·mol^(-1)·s^(-1),K_(d)为(1.46±0.04)×10^(-2)s^(-1),K_(D)为(4.88±0.31)×10^(-9)mol·L^(-1),RSD均<10%。经3次实验测定,SPR法测得抗CD79b单抗与CD79b的EC_(50)为(78.68±6.35)ng·mL^(-1),相对效价为(84.62±6.63)%,RSD均<10%;测得抗CD79b单抗-vc-MMAE与CD79b的EC_(50)为(35.93±0.75)ng·mL^(-1),相对效价为(84.74±1.76)%,RSD均<5%。经3次实验测定,ELISA法测得抗CD79b单抗与CD79b的EC_(50)为(22.66±0.41)ng·mL^(-1),相对效价为(95.70±1.74)%,RSD均<5%;测得抗CD79b单抗-vc-MMAE与CD79b的EC_(50)为(69.19±1.71)ng·mL^(-1),相对效价为(97.64±2.39)%,RSD均<5%,SPR和ELISA 2种方法结果基本一致。结论:建立了抗CD79b单抗及抗CD79b单抗-vc-MMAE的SPR法,并对靶点结合的动力学、亲和力进行评价,与ELISA方法在EC_(50)及相对效价方面进行了对比,为该类抗体偶联药物的研发提供参考。

相关疫苗上市后中国大陆肠道病毒71型C4亚型的分子流行特征分析

目的分析相关疫苗上市后中国大陆肠道病毒71型(enterovirus type 71,EV71)C4亚型的分子流行特征。方法基于贝叶斯的马尔可夫链蒙特卡罗(markov chain monte carlo,MCMC)分析方法,对EV71疫苗上市前后中国大陆EV71毒株VP1基因相似性进行比较。应用贝叶斯天际线模型和SpreaD3 v0.9.6软件对中国大陆C4亚型病毒进行系统发生地理学分析,通过绘制贝叶斯天际线图描绘种群动态历史变化,并应用EasyCodeML软件分析正选择压力位点。结果中国大陆EV71 C4亚型VP1基因序列的平均进化速率为2.25×10-3 site/year,C4a亚型毒株平均进化速率为3.1×10-3 site/year;EV71 C4亚型的起源可追溯至1990年的华东地区,C4a亚型可能起源于1999年。2002—2007年C4亚型经历了种群规模扩张,种群规模于2007年达峰值,且在EV71疫苗上市后仍保持较高水平。C4亚型病毒VP1基因中有5个氨基酸位点承受正选择压力,比对分析EV71疫苗上市后2015—2018年C4亚型病毒序列,筛选到VP1基因第289位点承受正选择压力。结论本研究揭示了EV71 C4亚型的遗传进化信息,为制定手足口病(hand,foot and mouth disease,HFMD)的防控策略提供了科学的数据支持。

百日咳和百日咳疫苗的现状与挑战

近年来出现的百日咳重现现象使百日咳成为疫苗可预防疾病中发病率最高的疾病。本文从百日咳的病原学、流行病学、疫苗构成和效果、预防接种意义、新免疫策略、新疫苗研发等方面论述了当前百日咳和百日咳疫苗的现状与挑战。

AA-PR8冷适应流感病毒疫苗株在小鼠中的保护作用

目的将AA-PR8冷适应流感病毒疫苗株免疫小鼠,检测小鼠IgG和IgA抗体产生情况,并对免疫后小鼠进行PR8流感病毒攻击,评价其保护效果。方法用AA-PR8冷适应流感病毒疫苗株滴鼻免疫小鼠2次,免疫间隔21 d,分别于第1次免疫后0、7、14、21、28、35和42 d采集小鼠血清和肺泡灌洗液,间接ELISA法检测IgG和IgA抗体效价。对采用1次免疫或0、14 d 2次免疫程序的小鼠进行5倍半数致死剂量的PR8流感病毒攻击,观察攻击后小鼠死亡情况及体重变化,攻击后第3天取小鼠肺脏,检测病毒载量。结果小鼠第1次免疫后7、14和21 d,血清IgG抗体GMT分别为152、230和264,肺泡灌洗液IgA抗体GMT分别为23、211和92;第2次免疫后7、14和21 d,血清IgG抗体GMT分别为348、919和1056,肺泡灌洗液IgA抗体GMT分别为53、368和160。免疫1次后14 d进行攻击,小鼠保护率为83.33%(5/6),体重降低幅度减少,肺脏病毒载量显著降低;0、14 d免疫2次后14 d进行攻击,小鼠保护率为100%(6/6),体重基本不降低,肺脏未检测到病毒。结论AA-PR8冷适应流感病毒疫苗株在小鼠中具有良好的免疫原性,显著降低小鼠AA-PR8流感病毒攻击后的肺脏病毒载量,提高了生存率。

AA-PR8冷适应流感病毒疫苗株的制备及质量评价

目的制备AA-PR8冷适应流感病毒疫苗株并进行质量评价。方法以A/Ann Arbor/6/60(H2N2)冷适应流感病毒PB2、PB1、PA、NP、M及NS 6个基因作为骨架,与PR8病毒HA、NA基因共同进行病毒拯救,制备AA-PR8冷适应流感病毒疫苗株,并评价其遗传稳定性、温度敏感性、冷适应表型以及在小鼠中的减毒特征。结果成功制备了AA-PR8冷适应流感病毒疫苗株,在鸡胚中传5代后,所有基因氨基酸位点均未发生突变。与PR8野病毒相比,AA-PR8疫苗株可在26℃条件下生长,不能在39℃条件下生长,具有温度敏感性及冷适应表型。与接种同等剂量的PR8野病毒的小鼠相比,接种AA-PR8疫苗株的小鼠体重降低幅度明显减小,未发生动物死亡;肺部病毒载量降低1000倍以上。结论成功制备了遗传稳定性好、具有温度敏感性及冷适应表型、小鼠致病能力弱的AA-PR8冷适应流感病毒疫苗株。

1株致病性黄疸出血群钩端螺旋体病流行菌株与其同血清群疫苗株的比较基因组学分析

目的对1株致病性黄疸出血群钩端螺旋体(简称钩体)病流行菌株与其同血清群疫苗株进行比较基因组学分析。方法应用高通量测序技术对黄疸出血群钩体流行株200502(简称流行株200502)进行全基因组序列测定,并与其同血清群疫苗株56601进行比较基因组学分析;选取GenBank中已公布的包括疫苗株56601在内的9株不同基因种的代表性钩体菌株构建系统发育进化树。结果流行株200502全基因组序列全长为4543190 bp,含有编码基因3580个,其中具有直系同源簇(clusters of orthologous groups,COG)功能2192个。流行株200502与疫苗株56601基因组平均核苷酸一致性为99.2%,存在共有基因3245个,流行株200502含有特有基因242个。以疫苗株56601为参考,在流行株200502中共鉴定出2005个插入缺失(indel)和19799个单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)位点,其中编码区有8485个同义SNP位点、3484个非同义SNP位点,涉及菌株的细胞运动、信号转导机制、防御机制等相关基因。流行株200502与L.interrogans、L.noguchii和L.kirschneri 3个基因种进化亲缘性较近。结论获得了我国当前黄疸出血群流行株200502基因组的基本特征,确定了其与血清型疫苗株56601的差异,为钩体疫苗的改进提供了实验依据。