北京地区实验动物中猴痘病毒感染情况调查

目的对北京地区实验动物中猴痘病毒(MPXV)感染情况进行调查。方法参照世界卫生组织(WHO)MPXV实验室检测指导意见,采用荧光PCR法检测北京地区实验动物中MPXV,共642只动物,包括猴127只、小鼠215只、大鼠80只、豚鼠40只、地鼠10只、兔85只、犬85只。其中猴采集咽拭子,大小鼠、豚鼠和地鼠等采集盲肠,兔和犬采集肛拭子,采集的样本加入适量灭菌PBS,盲肠样本充分匀浆,拭子样本涡旋振荡1 min,-70℃反复冻融3次,离心取上清提取核酸,荧光PCR检测MPXV DNA,最后对结果进行分析。结果经荧光PCR检测,127只猴、215只小鼠、80只大鼠、40只豚鼠、10只地鼠、85只兔、85只犬MPXV DNA均为阴性。结论目前未在北京地区实验动物中发现MPXV感染。

实验动物四种呼吸道病原菌实验室检测能力验证结果分析

目的通过实施实验动物支气管鲍特杆菌、嗜肺巴斯德杆菌、多杀巴斯德杆菌和鼠棒状杆菌检测能力验证活动,达到评估实验动物检测机构的检验能力,提高实验动物质量检测水平的目的。方法2021年和2022年按照中国合格评定国家认可委员会(China National Accreditation Service for Conformity Assessment,CNAS)相关准则设立NIFDC-PT-309和NIFDC-PT-363两个项目(分别检测实验动物样品中呼吸道病原菌支气管鲍特杆菌/嗜肺巴斯德杆菌、鼠棒状杆菌/多杀巴斯德杆菌),开展能力验证活动。制备4种实验动物呼吸道病原菌和阴性对照大肠埃希菌的冷冻干燥样品;均匀性和稳定性检验合格后,随机分组编号,将样品发放给参加单位,要求在规定时限提交检验报告和原始记录。反馈的结果与样品设置一致的判定为满意结果,不一致或未按时提交的判定为不满意结果。结果2021年共有29家实验室参加了NIFDC-PT-309项目,获得满意结果的实验室为27个,满意率为93.1%。2022年共有30家实验室参加了NIFDC-PT-363项目,满意率为100%。结论国内大多数实验动物质量检测机构具备较强的呼吸道病原菌检测能力,并且通过开展能力验证活动这一检测能力正在稳步提升。

猪细小病毒核酸检测实验室能力验证结果分析

目的通过实施猪细小病毒(porcine parvovirus,PPV)核酸检测实验室能力验证计划,了解相关检测实验室的检测水平,规范PPV核酸检测。方法2022年1—8月,中国食品药品检定研究院组织开展针对猪血清样品中PPV核酸检测的实验室能力验证计划(编号NIFDC-PT-364)。按照中国合格评定国家认可委员会(China National Accreditation Service for Conformity Assessment,CNAS)相关准则,通过在PPV为阴性的猪血清中加入灭活的PPV,制备能力验证样品。样品经均一性、稳定性测试合格后,发放各参加实验室。每个实验室发放3个样品。要求各实验室对PPV核酸进行定性检测,并在规定时间提交结果及相关原始记录。最后对各实验室提交的结果进行汇总分析。结果共有9家实验室报名参加本次能力验证,均在规定时间内反馈结果。其中8家实验室结果符合预期,占比88.9%;1家实验室的3个样品均检测为PPV阳性,与预期结果不符,判为不满意。大多数实验室采用实时荧光PCR检测方法,核酸提取采用国产试剂的实验室占多数,而PCR扩增试剂以进口试剂为主,采用不同品牌的试剂未对检测结果产生影响。个别实验室存在实验结果图谱不清晰、原始记录信息不全等问题。结论各参加实验室大多具备PPV核酸检测能力,检测细节方面还有待提升。

实验室病毒检测能力验证与粪便样本中小鼠诺如病毒的检测

目的通过对国际实验动物科学理事会(the International Council for Laboratory Animal Science,ICLAS)能力验证计划(Performance Evaluation Program,PEP)提供的4份病毒盲样进行检测,从而对实验室病毒检测能力进行验证,进一步提高实验室的病毒检测水平。方法对ICLAS提供的盲样信息进行分析,提取核酸进行PCR检测并对阳性产物进行测序验证。对诺如病毒阴性盲肠内容物进行不同倍数的稀释后,与诺如病毒培养液1∶1混合,使用两种不同的核酸提取试剂盒进行核酸提取,通过荧光定量PCR方法进行诺如病毒核酸检测,比较检测的核酸拷贝数。结果经过检测确定ICLAS提供的盲样分别为小鼠脑脊髓炎病毒、小鼠诺如病毒、小鼠轮状病毒以及小鼠乳酸脱氢酶增高症病毒。比较不同稀释度的盲肠内容物诺如病毒荧光定量PCR检测结果发现,使用病毒DNA/RNA提取试剂盒提取核酸,稀释度不高于1∶16时,检测结果相比于病毒对照出现不同程度的偏差,稀释度为1∶32时检测结果与病毒对照检测结果相近。使用病毒RNA提取试剂盒提取核酸,稀释度不低于1∶8时,检测结果与病毒对照相近。结论通过国际比对能力验证,说明本实验室病毒检测能力可靠,且经过污染实验研究,粪便样本1∶8稀释后使用病毒RNA提取试剂盒提取核酸为粪便中诺如病毒检测的最佳预处理方法。

建立我国自主知识产权的致癌性小鼠模型

致癌性试验是药物非临床安全性评价的重要内容之一。当前国内外普遍采用并认可基于ICH S1B指南建立的药物非临床致癌性试验替代方案。遗传修饰致癌性小鼠模型是替代方案中“卡脖子”的关键技术问题。从1997年ICH S1B指南发布至今,我国制药行业主要依赖进口获得小鼠模型,其价格高昂、进口周期长、条件严苛,且由于模型资源唯一,制药行业承受着成本高昂和供应链不稳的双重压力。本文概述了国内外致癌性试验相关指导原则,介绍了国内外主要的致癌性小鼠模型,包括Tg.rasH2、KI.C57-ras、p53^(+/-)小鼠等的构建、验证与应用历程,并展望了建立我国自主知识产权的致癌性小鼠模型以及标准化生产供应的途径。

SNP分型检测技术及其在大鼠遗传检测中的应用

单核苷酸多态性(SNP)是第三代分子遗传标记,由于其广泛性、遗传稳定性、二态性及易于自动化分型的特点,成为当前实验动物遗传检测领域中重要研究的遗传标记。本文概述了SNP概念及特点,重点阐述不同种类SNP分型技术,并对该技术在大鼠遗传检测研究中的应用进行回顾和展望。

IL2rg^(-/-)大鼠支持人RSV在体内的长期感染

目的为了克服已有人呼吸道合胞病毒(human respiratory syncytial virus,hRSV)动物模型的局限性,如半受纳性和感染持续时间短,本文利用TALEN基因编辑技术建立了IL2rg基因敲除(IL2rg^(-/-))的大鼠模型。方法用hRSV滴鼻感染该动物模型,观察感染期(0~35 d)的临床表征、体重及体温变化;记录不同时间点(滴鼻感染后第4、11、20、35天)鼻腔、气管、肺等呼吸道脏器的病毒总拷贝数;在观察终点(滴鼻感染后第35天)对感染动物的靶器官进行病理分析;观察不同时间点(滴鼻感染后第4、20、35天)外周血T、B、NK、NKT细胞的变化及不同时间点多种细胞因子的变化。结果(1)通过鼻内接种hRSV后,纯合的IL2rg基因敲除大鼠的呼吸道内能保持较高的病毒载量,鼻腔中病毒的平均峰值滴度能快速升至1×10^(10 )copies/g,至第5周时,病毒依然能维持复制,病毒载量亦可达到1×10^(7)copies/g。(2)但其鼻、气管和肺组织,无明显病变。(3)感染hRSV的IL2rg^(-/-)大鼠外周血B细胞含量有上升。(4)IL-6和MCP-1两种细胞因子都在感染前期上升,在观察终点回落。结论本研究基于TALEN技术建立了IL2rg^(-/-)大鼠模型,并发现该模型能很好地支持hRSV高水平复制和并长期感染,为抗病毒药物筛选、抗hRSV抗体体内效力评价,提供了良好的动物模型。

hKDR^(+/+)人源化及Rag1^(-/-)基因缺陷新型双靶点遗传修饰荷瘤小鼠模型的建立

目的通过增强血管内皮生长因子受体(vascular endothelial growth factor receptor,VEGFR)人源化小鼠(hKDR^(+/+))接纳不同来源的小鼠肿瘤细胞系的潜力,建立能支持多种肿瘤细胞系成瘤的、可评价针对VEGFR靶点药物的新型荷瘤小鼠模型。方法首先建立基于hKDR^(+/+)人源化小鼠模型评价针对VEGFR靶点抗体体内活性的方法,同时采用CRISPR/Cas9技术构建重组激活基因1(recombination activating gene 1,Rag1)敲除的C57BL/6N小鼠(命名为Rag1^(-/-)小鼠)。然后将Rag1^(-/-)小鼠与hKDR^(+/+)小鼠交配,筛选获得双基因纯合、双靶点基因修饰的hKDR^(+/+)/Rag1^(-/-)小鼠。最后在hKDR^(+/+)、Rag1^(-/-)、hKDR^(+/+)/Rag1^(-/-)和C57BL/6N小鼠上测试不同小鼠品系来源肿瘤细胞系的体内肿瘤生长差异。结果针对VEGFR靶点设计的抗体在hKDR^(+/+)小鼠体内表现出明显的抗肿瘤活性,与PBS组相比,肿瘤体积明显减小(P<0.01),肿瘤质量明显减轻(P<0.05)。Rag1^(-/-)小鼠、hKDR^(+/+)/Rag1^(-/-)小鼠的外周血B细胞和T细胞数量均明显减少(P<0.05,P<0.001)。C57BL/6小鼠来源的MC38细胞接种7 d后,在hKDR^(+/+)/Rag1^(-/-)、Rag1^(-/-)、C57BL/6N和hKDR^(+/+)四组小鼠体内均可见肿瘤生长。BALB/c小鼠来源的CT26细胞接种10 d后,仅在hKDR^(+/+)/Rag1^(-/-)和Rag1^(-/-)小鼠体内见到肿瘤生长,在C57BL/6N及hKDR^(+/+)小鼠中均未见肿瘤生长;接种后3周,hKDR^(+/+)/Rag1^(-/-)小鼠的成瘤体积明显大于Rag1^(-/-)小鼠(P<0.01)。结论获得了Rag1基因敲除小鼠,并进一步筛选获得新型hKDR^(+/+)/Rag1^(-/-)双靶点基因修饰小鼠模型;Rag1基因缺失时,不同品系小鼠来源的肿瘤细胞系更易成瘤。这提示可以通过降低hKDR^(+/+)人源化小鼠的免疫反应能力,增强或扩大该模型小鼠接纳肿瘤细胞系的范围,构建多种可用于评价VEGFR靶点药物的荷瘤小鼠模型。

鼠肺炎病毒实时荧光定量聚合酶链反应方法的建立及其在新型冠状病毒感染模型用小鼠等动物检测中的应用

目的建立鼠肺炎病毒(pneumonia virus of mice,PVM)实时荧光定量聚合酶链反应(real-time fluorescent quantitative polymerase chain reaction,Q-PCR)检测方法,用于新型冠状病毒感染模型用小鼠等实验动物及其动物相关样本的检测。方法选择PVM G基因保守序列设计合成引物和探针,建立Q-PCR方法。并进行方法的线性、特异性、敏感性、重复性、稳定性和可信度验证。应用建立的方法对包括用于构建新型冠状病毒感染模型用hACE2等8个品系142只小鼠,及15只大鼠、5只沙鼠、4只黄鼠、63只裸鼹鼠和19只PVM感染小鼠的肺组织样本进行PVM检测。结果建立的方法与仙台病毒、呼肠孤病毒Ⅲ型、汉坦病毒、淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒无交叉反应。方法的线性范围为1×10^(1)-1×10^(8)拷贝/μl,检测病毒质粒标准品灵敏度达101拷贝/μl;重复性、稳定性结果显示实验内和实验间平均变异系数均<5%。用建立的方法检测用于构建新型冠状病毒感染模型用hACE2等8个品系142只小鼠,及15只大鼠、5只沙鼠、4只黄鼠和63只裸鼹鼠,结果均为阴性;检测19只PVM感染小鼠肺组织样本,PVM阳性率为36.84%(7/19),与RT-PCR检测结果符合率为100%。结论建立的PVM Q-PCR方法特异性、敏感性,重复性、稳定性好,检测结果可靠,能够用于构建新型冠状病毒感染模型常用品系小鼠等实验动物的监测及其相关样本的检测。未发现用于构建新型冠状病毒感染模型常用品系小鼠携带PVM。

海立啮齿杆菌OmpA的原核表达及免疫效果

目的 探讨海立啮齿杆菌(Rh)外膜蛋白A(OmpA)原核表达蛋白对小鼠的免疫效果。方法 采用原核表达、镍离子亲和层析纯化,制备Rh OmpA重组蛋白,并用SDS-PAGE和Western blot进行鉴定。获得的OmpA目的蛋白经腹腔、肌肉联合注射和滴鼻两种方案免疫ICR小鼠,由ELISA方法测定其抗体滴度。再分别将Rh ATCC12555、嗜肺啮齿杆菌(Rp)ATCC35149和Rh分离株PP320对免疫小鼠腹腔接种攻毒,评价重组蛋白OmpA对小鼠的保护效果。结果 以表达蛋白OmpA为包被抗原的ELISA方法检测免疫小鼠血清中OmpA特异性抗体水平,平均抗体滴度为19.84log_(2)。免疫小鼠对两标准菌株和PP320的保护率分别为60%、60%和80%,与未免疫小鼠相比死亡率显著降低(P<0.001)。基于OmpA表达蛋白建立的ELISA方法检测嗜肺巴斯德杆菌(Pp)阳性小鼠血清,抗体阳性率为60%。结论 制备的Rh OmpA表达蛋白有良好的免疫原性,对Rh和Rp具有一定的保护效果,为实验动物中呼吸道病原菌的防控提供参考。

海立啮齿杆菌OmpA基因缺失株的构建及其生物学特性

目的 探究外膜蛋白A(OmpA)基因与海立啮齿杆菌(Rh)致病性的关系。方法 采用同源重组技术构建海立啮齿杆菌分离株OmpA基因缺失株,分析其生长特性、遗传稳定性、生化特征、质谱特征、生物被膜产生能力、对小鼠肺上皮细胞(MLE-12)的黏附力,及对小鼠的致病性。结果 成功构建海立啮齿杆菌OmpA基因缺失株,可稳定遗传。与野生型菌株相比,生化特征未发生改变,质谱峰图和生长曲线基本一致,生物膜形成能力显著增强(P<0.01);对MLE-12细胞的黏附力从43.9%降低至18.3%(P<0.001);对小鼠腹腔攻毒,致死率从100%降至20%(P<0.01),基因缺失株对小鼠致病力显著下降。结论 OmpA基因的缺失致使海立啮齿杆菌的致病性明显减弱,证实OmpA在海立啮齿杆菌的感染过程中发挥着重要作用。

4种SPF级大鼠活体保种繁殖性能测定与分析

目的 测定、分析国家啮齿类实验动物资源库活体保存的4种SPF级大鼠(SD、Wistar、F344和BN)的繁殖水平。方法 封闭群采用循环交配方法[1],近交系采用修饰平行线交配方法。检测4种品系SPF大鼠第1~4胎的产仔平均数、带仔平均数和离乳平均数,计算出离乳率。并记录初次交配日龄、初次生产日龄、初次生产间隔和所产各胎的胎间隔。结果 SD大鼠的产仔平均数为12~13只,前二胎繁殖水平基本维持相对稳定,第3、4胎的各项检测指标结果相比第1、2胎呈现下降趋势;SD大鼠的离乳率为98.2%;SD大鼠的初次交配日龄、初次生产日龄、初次生产间隔分别为84、110.7、26.7 d左右,所产各胎的胎间隔在26~31 d。Wistar大鼠的平均产仔数为10~11只,前2胎的每窝产仔平均数、带仔平均数和离乳平均数水平基本相对稳定,3、4胎各项检测指标结果相比第1、2胎呈现下降趋势;方差分析结果也表现出所产各胎的产仔平均数有显著差异(P<0.05);Wistar大鼠的离乳率为98.3%;Wistar大鼠的初次交配日龄、初次生产日龄、初次生产间隔分别为91、118.5、27.5 d左右,所产各胎的胎间隔在25~30 d。F344大鼠第1~4胎的产仔平均数是8只,前3胎每窝产仔平均数、带仔平均数和离乳平均数基本维持相对稳定,第4胎各项检测指标比前3胎呈现明显下降趋势(P<0.05);方差分析结果也显示出各胎次的产仔平均数有显著的差异(P<0.05);F344大鼠的离乳率为98.4%;F344大鼠的初次交配日龄、初次生产日龄、初次生产间隔分别为92.7、122.7、30 d左右,所产各胎的胎间隔在27~40 d。BN大鼠第1~4胎的产仔平均数是5只,4胎的每窝产仔平均数、带仔平均数和离乳平均数基本维持相对稳定,BN大鼠的离乳率为98.9%;BN大鼠的初次交配日龄、初次生产日龄、初次生产间隔分别为82.8、124.6、41.8 d左右,所产各胎的胎间隔在33~37 d。结论 本资源库活体保存的4种SPF级大鼠繁殖水平较高,得到的繁殖水平参数为全国各区域实验大鼠规模化生产和国家啮齿类实验动物种质资源库的建设提供了参考依据。