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重组细胞中鼠细小病毒检测方法的建立及初步应用 被引量:4
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作者 吴雪伶 樊金萍 +3 位作者 冯建平 宋丽京 孟淑芳 李德富 《中国生物制品学杂志》 CAS CSCD 2012年第8期1030-1034,1042,共6页
目的建立生物技术产品用重组细胞中鼠细小病毒(Murine minute virus,MMV)污染的检测方法,并进行验证及初步应用。方法以NB324K细胞为指示细胞,建立MMV感染性检测方法,并以不同CCID50的MMV分别感染NB324K细胞,验证方法的灵敏度;通过设计... 目的建立生物技术产品用重组细胞中鼠细小病毒(Murine minute virus,MMV)污染的检测方法,并进行验证及初步应用。方法以NB324K细胞为指示细胞,建立MMV感染性检测方法,并以不同CCID50的MMV分别感染NB324K细胞,验证方法的灵敏度;通过设计针对编码非结构蛋白1(Non-structural protein 1,NS1)保守序列的引物和探针,建立用于重组细胞中MMV检测的实时荧光定量PCR,并对其线性、特异性、精密性、灵敏度、最低检测限及试验可行性和干扰性进行验证;将NB324K细胞感染试验与荧光定量PCR法相结合,建立NB324K细胞感染-PCR法,并通过对大量样本的检测,分析荧光定量PCR法和NB324K细胞感染-PCR法的可行性。结果 NB324K细胞感染试验的灵敏度为0.2 CCID50;荧光定量PCR检测方法最佳线性范围为1×108~1×104拷贝/μl,R2达0.99以上,特异性良好,与其他种属的细小病毒均无交叉反应,试验内和试验间Ct值的变异系数(CV)均小于5%,试验内病毒定量拷贝数的CV在20%~30%之间,试验间病毒定量拷贝数的CV在20%~50%之间,灵敏度为5×103拷贝/μl,最低感染性病毒颗粒检测限为2 CCID50。该方法能够用于细胞样品中MMV的检测,部分样品基质对病毒的检测具有一定的干扰性。NB324K细胞感染-PCR法的灵敏度为0.02 CCID50,检测时间可缩短为96 h,与荧光定量PCR法分别对47份样品进行检测,结果均为阴性。结论成功建立了MMV荧光定量PCR检测方法和NB324K细胞感染-PCR法,可应用于重组细胞中MMV污染的检测,为进一步提高生产用重组细胞的安全性奠定了基础。 展开更多
关键词 小鼠细小病毒 荧光定量PCR 重组 细胞 感染
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戊型肝炎病毒ORF3蛋白研究进展 被引量:3
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作者 周艳 耿彦生 +1 位作者 杨军 王佑春 《中华微生物学和免疫学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2012年第9期825-830,共6页
戊型肝炎病毒(hepatitis E virus,HEV)是戊型肝炎的病原体,是肝炎病毒科戊型肝炎病毒属的惟一成员,无包膜、正义、单链RNA病毒,病毒基因组全长约7.2kb,由3个开放阅读框ORFl、ORF2和ORF3组成,其中ORFl编码与病毒复制、转录相关... 戊型肝炎病毒(hepatitis E virus,HEV)是戊型肝炎的病原体,是肝炎病毒科戊型肝炎病毒属的惟一成员,无包膜、正义、单链RNA病毒,病毒基因组全长约7.2kb,由3个开放阅读框ORFl、ORF2和ORF3组成,其中ORFl编码与病毒复制、转录相关的酶等非结构蛋白,ORF2编码660aa的病毒衣壳蛋白,ORF3编码小分子的磷蛋白。 展开更多
关键词 戊型肝炎病毒 ORF3蛋白 单链RNA病毒 ORF2 肝炎病毒属 病毒基因组 开放阅读框 非结构蛋白
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湖北地区人源与猪源戊型肝炎病毒部分基因序列的分析 被引量:12
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作者 赵晨燕 刘小桂 +3 位作者 樊金萍 李秀记 宋爱京 王佑春 《中国病毒病杂志》 CAS 2013年第1期27-31,共5页
目的调查湖北地区戊型肝炎病毒(HEV)人源与猪源基因型的流行情况。方法用套式RT-PCR方法对湖北地区25例急性戊型肝炎患者血清和33份用实时荧光RT-PCR检测为HEV核酸阳性的猪血清进行HEV RNA检测。HEV核酸使用QIAamp Viral RNA Mini Kit(Q... 目的调查湖北地区戊型肝炎病毒(HEV)人源与猪源基因型的流行情况。方法用套式RT-PCR方法对湖北地区25例急性戊型肝炎患者血清和33份用实时荧光RT-PCR检测为HEV核酸阳性的猪血清进行HEV RNA检测。HEV核酸使用QIAamp Viral RNA Mini Kit(QIAGEN)提取,用AMV ReverseTranscriptase(Promega)进行逆转录合成cDNA,所用扩增引物为基于HEV ORF2区域的简并引物,并对阳性产物进行克隆测序,对所得序列进行同源性比较和进化树分析。结果用RT-PCR从25份急性戊型肝炎患者血清和33份猪血清中分别检出HEV RNA阳性者9份和8份。序列分析显示17株戊型肝炎病毒株在ORF2部分区域的核苷酸序列同源性为82%~100%,氨基酸同源性为87%~100%。该17株戊型肝炎病毒序列与HEV 4型代表株的核苷酸序列的同源性为82%~94%,均为HEV 4型,而且人源和猪源HEV均分为相同的4个亚型。进化树分析显示该17株戊型肝炎病毒株分属于4个不同的亚型分支。结论湖北地区人与猪群中流行的HEV基因型以及亚型相同。 展开更多
关键词 戊型肝炎病毒 套式RT-PCR 基因型
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