BRCA基因突变检测的标准化研究

目的使用BRCA基因突变国家参考品,评价BRCA1/2基因突变检测试剂盒(联合探针锚定聚合测序法)的性能。方法取国家参考品的基因组DNA,进行打断和末端修复,获得片段化的DNA。使用连接酶在DNA两端加上接头。经pre-PCR扩增获得杂交前文库(pre-PCR文库),再用探针特异性捕获含目标区域的DNA片段,经post-PCR扩增获得杂交后文库(post-PCR文库)。使用通用测序试剂盒进行测序,得到原始下机数据。通过数据分析,得到国家参考品的BRCA基因变异信息,从而对试剂盒的准确性、特异性和重复性进行评价。结果试剂盒能够准确检出试剂盒检测范围内的BRCA基因突变位点,并且按照BRCA基因解读规则能够进行正确解读;没有检出其他非标示的致病性或疑似致病性突变位点。使用同一批次试剂盒重复检测国家参考品3次,每次结果均能满足准确性和特异性的要求。结论BRCA基因突变国家参考品可以用于评价BRCA1/2基因突变检测试剂盒(联合探针锚定聚合测序法)的性能,实现对BRCA基因突变检测的标准化。

生长激素定量标记免疫分析试剂盒行业标准的验证

目的:制订生长激素(GH)定量标记免疫分析试剂盒行业标准,并采用该标准适用的化学发光标记、时间分辨荧光标记方法进行验证。方法:选择GH磁微粒化学发光法、电化学发光法、化学发光法和时间分辨荧光分析法试剂盒,按照拟定的行业标准规定,对空白限、线性、准确度、精密度、特异性和稳定性项目进行验证。结果:除部分试剂盒的准确度结果不能满足预期要求的±10%外,其余验证结果均能满足拟定行业标准中的要求。结论:根据验证情况,将准确度要求调整至±15%,其余项目要求不变,最终确定GH定量标记免疫分析试剂盒行业标准。该标准的制定,有助于统一GH定量标记免疫分析试剂盒的质量标准,为该类产品的研制、检验及上市后的监督管理提供依据。

肿瘤基因突变检测的标准化研究

目的探索制备EGFR和ALK等肿瘤基因突变参考品的方法,用于评价肿瘤基因突变检测试剂盒(二代测序法)的性能。方法收集EGFR和ALK等基因突变的组织切片和细胞系,提取样本的DNA和RNA。采用数字PCR方法对样本对应的基因突变进行验证和定量,确定阳性参考品及其突变比例;然后将阳性参考品和野生型样本混合,稀释至突变率为5%和含100个融合RNA拷贝数的样本,经数字PCR定量后,作为检测限参考品。采用肿瘤基因突变检测试剂盒(二代测序法)进行准确性和检测限项目检测。结果数字PCR的结果表明成功制备了阳性参考品和检测限参考品,并确定其突变比例;制备的参考品能被肿瘤基因突变检测试剂盒(二代测序法)正确检出。结论建立了制备肿瘤基因突变参考品的方法,制备的参考品可以用于评价肿瘤基因突变检测试剂盒(二代测序法)的性能。

锂、钠、钾、镁、钙、氯复合电解质冰冻人血清国家标准品的研制和性能评价

目的研制锂、钠、钾、镁、钙、氯复合电解质冰冻人血清国家标准品,并评价其性能,促进锂、钠、钾、镁、钙、氯电解质测定的标准化。方法收集含不同浓度锂、钠、钾、镁、钙、氯离子的无溶血、脂血和黄疸血清,经多重过滤、除菌后分装,制备成3个水平的候选品,-70℃保存。以钾离子作为均匀性评价的特性量,采用单因素方差分析评价候选品的均匀性。以钾、钠、氯离子作为稳定性评价的特性量,采用线性回归分析评价候选品的稳定性。采用参考方法或经验证的方法定值,并计算不确定度。评估候选品、新鲜血清样本在参考方法或经验证的方法与4个常规检测系统间的互通性。结果3个水平侯选品中,钾离子的均匀性检验F值分别为1.6301、1.4986和1.0208,均<F0.05;钾、钠、氯离子在2~8℃、20~25℃和-20℃条件下,均至少可稳定30d。3个水平侯选品中,锂离子定值结果分别为(0.649±0.022)、(1.195±0.032)、(1.334±0.008)mmol/L(k=2),钠离子定值结果分别为(120.057±2.206)、(142.030±1.521)、(158.228±1.293)mmol/L(k=2),钾离子定值结果分别为(5.042±0.143)、(5.739±0.106)、(6.158±0.094)mmol/L(k=2),镁离子定值结果分别为(0.732±0.021)、(0.857±0.026)、(1.144±0.026)mmol/L(k=2),钙离子定值结果分别为(2.014±0.078)、(2.348±0.056)、(3.070±0.024)mmol/L(k=2),氯离子定值结果分别为(90.814±2.005)、(108.875±0.908)、(128.156±1.453)mmol/L(k=2)。钠、钾、镁、钙和氯离子3个水平侯选品浓度均在新鲜血清样本的95%可信区间内,互通性良好。结论制备的锂、钠、钾、镁、钙、氯复合电解质冰冻人血清国家标准品候选品均匀性、稳定性好,钠、钾、镁、钙和氯离子侯选品互通性良好,定值准确可靠,可作为国家标准品使用。

尿素、尿酸和总蛋白复合冰冻人血清国家标准品的研制

目的研制尿素、尿酸和总蛋白复合冰冻人血清国家标准品,用于校准和评价常规方法,促进尿素、尿酸和总蛋白测定的标准化。方法收集含不同浓度尿素、尿酸和总蛋白的血清(无溶血、脂血和黄疸)样本,过滤除菌后分装,于-70℃保存。采用单因素方差分析评价候选品的均匀性。通过线性回归方差分析进行稳定性研究。采用参考方法或经验证的方法定值,计算不确定度。对候选品及25份新鲜血清样本在参考方法(或经验证的方法)及3个常规检测系统间的互通性进行评估。结果候选品中尿素、尿酸和总蛋白均匀性检验F值分别为1.071 4、1.339 9和1.275 0,均<F0.05。在-20℃条件下,候选品中尿素、尿酸和总蛋白均至少可稳定37 d;在2~8℃条件下,尿素可稳定27 d,尿酸及总蛋白至少可稳定37 d;在20~25℃条件下,尿素仅能稳定3 d,尿酸可稳定8 d,总蛋白可稳定27 d。定值结果分别为:尿素(5.68±0.17)mmol/L(k=2)、尿酸(288.68±3.96)μmol/L(k=2)、总蛋白(67.03±3.46)g/L(k=2)。尿素、尿酸和总蛋白浓度全部在25份血清样本的回归直线95%可信区间范围内。结论研制的尿素、尿酸和总蛋白复合冰冻人血清国家标准品候选品均匀性、稳定性、互通性良好,定值准确、可靠。

测序仪性能评价用脱氧核糖核酸国家参考品的建立

目的建立测序仪性能评价用脱氧核糖核酸国家参考品。方法分别将扩增培养后的永生化的人细胞系、培养达到10^(8)数量级的转染HPV11质粒的细菌、大肠杆菌和欧陆森氏菌高GC菌株收集后提取基因组DNA,然后进行DNA浓度测定。接着将人基因组DNA、HPV病毒基因组DNA、大肠杆菌基因组DNA和高GC菌株基因组DNA分别按照20、5、50、50 ng/μl终浓度要求,进行分装,制备国家参考品。在不同的基因测序仪进行上机测序,包括BGISEQ-500、NextSeq CN500、NovaSeq 6000和BioelectronSeq 4000等。构建人全基因组变异标准集和一致性序列。采用不同测序平台进行协作标定,评价变异标准集和一致性序列的适用性。结果制备的国家参考品经不同平台测序后构建了人全基因组变异标准集和一致性序列。经过不同测序平台标定,结果符合人全基因组变异标准集和一致性序列的要求。结论测序仪性能评价用脱氧核糖核酸国家参考品可以用于高通量基因测序仪的性能评价,为产品注册检定及上市后监督管理提供依据。

化学发光法检测女性自身免疫生殖相关抗体的临床应用评价

目的:研究自身免疫抗体在女性生殖相关疾病诊断中的应用价值。方法:选择卵巢早衰(Premature Ovarian Failure,POF)患者30例、多囊卵巢综合征(Polycystic Ovarian Syndrome,PCOS)患者30例、子宫内膜异位症患者40例、不孕不育患者80例以及健康女性50例;采用化学发光检测技术检测这230例血清样本中的抗精子抗体[anti sperm antibody,ASA(IgG/IgM)]、抗卵巢抗体[anti ovarian autoantibody,AOA(IgG/IgM)]、抗子宫内膜抗体[endometrial antibody,EMAb(IgG/IgM)]和抗透明带抗体[zona pellucida antibodies,ZPAb(IgG/IgM)];用数据处理统计软件MedCalc分析每个检测项目数据。结果:在2%的健康人群血清中查出了IgG抗体,但没查出IgM抗体。AOA(IgG/IgM)检测对POF和PCOS诊断有指导意义。在POF患者样本中,AOA(IgG/IgM)的阳性率为66.7%,显著高于健康人样本的检出率2%(P<0.001),在PCOS患者样本中的阳性率为36.7%,同样显著高于健康人样本的检出率(P<0.001)。EMAb和子宫内膜异位症有很高的相关性,联合检测IgG分型和IgM分型在阳性组的检出率为57.5%,显著高于健康人样本的检出率2%(P<0.001)。联合检测ASA(IgG/IgM)、AOA(IgG/IgM)、EMAb(IgG/IgM)和ZPAb(IgG/IgM)分析80例不明原因不孕患者样本,阳性检出率为30%,显著高于健康人样本的检出率4%(P<0.001)。结论:采用化学发光法检测ASA、AOA、EMAb、ZPAb对POF、PCOS、子宫内膜异位症和女性不孕不育症等疾病的临床诊断有重要指导意义。