改革医学免疫学实验教学的一些体会

医学免疫学是一门实用性极强的学科,是医学生的必修课。为培养高素质的医 学人才,我们对医学免疫学实验教学做了几方面的改进,包括建立综合实验体系,采取形式 多样的教学方法,注重能力培养,做好实验课前的准备工作等。

IL-12恢复并促进氟尿嘧啶抑制的T细胞免疫功能

背景与目的:目前,氟尿嘧啶(5-fluorouracil,5-FU)仍然是临床上广泛应用的肿瘤化疗药物之一。白细胞介素-12(interleukin-12,IL-12)的生物学功能是促进Th1细胞分化以及诱导CD8+T细胞γ干扰素(interferon-γ,IFN-γ)的产生。本研究进一步探讨5-FU对正常人外周血T细胞介导免疫应答的抑制机制,以及IL-12是否能够恢复由5-FU引起的免疫抑制功能。方法:观察5-FU对正常人外周血单核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)及肝癌细胞株HepG2增殖和活性的影响。另外,PBMCs在anti-CD3或anti-CD3+anti-CD28刺激的条件下,加入不同浓度5-FU(0.20～50.00μg/ml)共同培养,ELISA法检测培养上清中IFN-γ的水平。PBMCs预先加入或不加入5-FU共同培养后,再分别加入anti-CD3+anti-CD28刺激,利用流式细胞术分析T细胞亚群表达细胞因子IFN-γ和IL-2以及细胞活化分子CD25表达的变化。Anti-CD3+anti-CD28、IL-12、5-FU不同配伍组合与PBMCs共培养后收集上清液,ELISA法检测IFN-γ水平,然后利用流式细胞术检测T细胞亚群IFN-γ表达的变化。结果:5-FU抑制PBMCs和HepG2细胞的增殖,同时以浓度依赖方式抑制正常人PBMCsIFN-γ的产生(P=0.024)。T细胞亚群分析的结果表明,加入5-FU组与未加入5-FU组相比,表达IFN-γ的CD4+T细胞百分率从2.1%下降到0.7%,CD8+T细胞百分率从3.9%下降到2.2%;表达IL-2的CD4+T细胞百分率从2.5%下降到0.7%,CD8+T细胞百分率从0.4%下降到0.2%;同时这两种细胞亚群CD25的阳性率和平均荧光密度都明显降低。anti-CD3+anti-CD28组,加入IL-12前表达IFN-γ的CD4+和CD8+T细胞百分率分别为1.1%和3.2%,加入IL-12后分别为1.6%和4.1%;anti-CD3+anti-CD28+5-FU组,加入IL-12前表达IFN-γ的CD4+和CD8+T细胞百分率分别为0.5%和1.1%,加入IL-12后分别为1.0%和2.5%。结论:5-FU抑制肿瘤细胞增殖的同时也抑制正常人的免疫功能,IL-12能够恢复并促进由5-FU抑制的T细胞免疫功能。

宫颈癌患者外周血来源的树突状细胞的生物学特性观察

【目的】探讨宫颈癌患者外周血来源的树突状细胞(DC)的生物学特性。【方法】14例Ib期及以上的宫颈癌患者为研究组,24例健康女性为对照组。外周血经密度梯度离心得到单个核细胞,其中附壁成分在含GM-CSF/IL-4的完全淋巴细胞培养液培养。光镜和电镜观察培养细胞的形态变化。培养7d后,计算树突状细胞的产量,流式细胞术分析HLA-ABC、HLA-DR、CD40、CD80、CD1a和CD14的表达,同种异体淋巴细胞的混合淋巴反应(MLR)检测树突状细胞刺激淋巴细胞增殖能力。【结果】经过7d培养,两组均诱导出典型形态和表型的DC。宫颈癌患者单位体积外周血的未成熟DC(ImDC)的产量为67.3×106±33.8×106,较对照组低(P<0.05)。研究组的CD40、CD80和CD1a的平均荧光强度(MFI)分别为18±9,15±6和71±11,均较对照组低(P<0.05);而两组ImDC的HLA-ABC、HLA-DR表达强度相似(P>0.05)。相同PBL/DC比值,研究组ImDC刺激同种异体淋巴细胞增殖能力下降(P<0.05)。【结论】宫颈癌患者的外周血单个核细胞培养的树突状细胞(ImDC)和健康对照组的ImDC具有免疫学差异,提示在应用树突状细胞进行免疫治疗时应考虑这种差异。

人外周血NKT细胞亚群表型及生物学特征

目的:观察正常人周围血NKT细胞的频率、表型特征及功能,进一步了解NKT细胞在免疫应答中的作用。方法:分离正常成年人PBMCs,利用流式细胞术(FCM)检测TCRvβ11、CD4、CD8、CD45RA、CD62L、CCR7等表面分子的表达;PMA+Ionomycin刺激PBMCs后,检测细胞因子的产生。结果:正常成年人周围血CD3+TCRvβ11+NKT细胞的平均频率为0.35%,其范围为0.11%～1.20%。根据CD4和CD8分子的表达,可将CD3+TCRvβ11+NKT细胞分为CD4+、CD8+、CD4-CD8-三个亚群,分别为56.24%、25.82%、16.47%。此外多数CD3+TCRvβ11+NKT细胞表达CD45RA,近半数细胞表达CD62L,少数细胞表达CCR7。细胞因子表达的结果显示,经PMA和Ionomycin刺激后,近30%的CD3+TCRvβ11+NKT细胞分泌IFN-γ,6.9%的细胞分泌IL-4。CD4+NKT细胞产生IL-4的量要明显高于CD8+NKT细胞,但IFN-γ的表达二者没有明显差别。重要的是初始和记忆性NKT细胞都能产生细胞因子,以记忆性NKT细胞为主。结论:正常人周围血中CD3+TCRvβ11+NKT细胞的频率很小,但其表型复杂,产生细胞因子IFN-γ和IL-4的频率高,参与免疫调节及免疫应答的过程。

抗人CD154单克隆抗体抑制免疫应答的实验研究

目的 :探讨抗人CD1 54单克隆抗体对免疫应答的抑制作用。方法 :①在体外进行混合淋巴细胞反应 ,研究抗人CD1 54单克隆抗体对淋巴细胞增殖反应的影响 ;②在严重免疫联合缺陷 (SCID)鼠体内重建人的免疫功能后 ,研究抗人CD1 54单克隆抗体在SCID小鼠体内对T细胞增殖的影响和对B细胞功能的影响。结果 :①双向混合淋巴细胞反应结果显示 ,抗体的 5个剂量组的 [3H] -TdR的掺入率均显著低于对照组 (均P <0 .0 1 ) ;②在输注人外周血单个核细胞第 6d、第 1 2d、第 2 1d ,实验组SCID鼠体内人T细胞占SCID鼠淋巴细胞的百分率均明显低于对照组(均P <0 .0 5) ;在输注人外周血单个核细胞后的第 1 2d、第 2 1d、第 31d ,实验组SCID鼠体内人IgG的含量明显低于对照组 (均P <0 .0 5)。结论 :抗人CD1 54单克隆抗体能够在体外抑制淋巴细胞的增殖 。

基因免疫制备抗人BLyS单克隆抗体及单抗特性分析

目的 :基因免疫制备抗人BLyS单克隆抗体并分析其免疫学特性。方法 :将人BLyS基因克隆到真核表达载体pcDNA3,构建重组质粒pcDNA3/hBLyS ,用其免疫BALB/c鼠 ,取鼠脾细胞与骨髓瘤细胞融合 ,用ELISA法筛选阳性克隆 ,用免疫印迹和流式细胞技术进一步鉴定抗体的特异性 ,用双向免疫扩散鉴定单克隆抗体的类别。结果 :重组质粒双酶切结果和DNA序列测定结果表明 ,pcDNA3/hBLyS重组质粒含有目的基因 ;ELISA、免疫印迹、流式细胞仪和双向免疫扩散等实验结果表明 ,9c10杂交瘤细胞株产生的单克隆抗体可以特异性结合IFN -γ激活的人T淋巴细胞膜表面BLyS蛋白的膜外区 ,属于IgG1亚类。结论 :获得了能够特异性结合人T淋巴细胞上BLyS蛋白膜外区的单克隆抗体 。

PSMA基因疫苗抑瘤效应及免疫机制的实验研究

目的:观察表达前列腺特异性膜抗原(PSMA)基因疫苗在荷瘤小鼠模型中抑瘤效应并探讨其免疫机制,为前列腺癌的预防和免疫治疗提供实验基础。方法:将PSMA基因疫苗肌注入BALB/c小鼠体内,检测其血清中PSMA抗体水平并观察脾T细胞的增殖效应和杀细胞毒效应,以sp2/0-PSMA细胞攻击免疫后小鼠,观察小鼠的成瘤率、肿瘤大小、平均瘤重及生存率,评价PSMA基因疫苗的抑瘤效应。结果:PSMA基因疫苗可诱导实验组小鼠产生PSMA抗体,脾T细胞的增殖效应和杀细胞毒效应,在一定时间内随着免疫次数的增加和时间的延长,抗体水平、脾细胞的增殖和杀细胞毒效应均呈上升趋势。与对照组相比较,实验组小鼠成瘤率低,无瘤生存期延长,肿瘤生长缓慢。结论:PSMA基因疫苗能诱导实验组小鼠产生特异性体液及细胞免疫应答,且有明显的抑瘤效应。

促进胚胎干细胞来源造血干/祖细胞移植后细胞免疫功能恢复

目的 :体外诱导胚胎干细胞分化为造血干 /祖细胞过程中 ,增加成熟T淋巴细胞的含量 ,以促进其重建致死量照射小鼠的造血功能后免疫功能的早期重建。方法 :胚胎干细胞在含甲基纤维素的培养基中自由分化形成胚胎体 ,分化第 6d添加造血生长因子 ,同时添加胸腺肽 ,流式细胞仪检测分化细胞中CD3 4 + 的造血干 /祖细胞和CD+ 3 的成熟T淋巴细胞含量 ,最后将分化细胞注射入致死量照射小鼠体内 ,观察 6 0d ,以移植物抗宿主病 (GVHD)发病率作为T淋巴细胞免疫功能的指标 ,用PCR检测Sry反映移植细胞在宿主体内的存活。结果 :分化第 13d ,未加胸腺肽 ,CD+ 3 的成熟T淋巴细胞含量仅 10 5 2 % ,重建造血后无GVHD发生 ;添加胸腺肽 ,CD+ 3 的成熟T淋巴细胞含量升高达 2 2 93% ,重建造血后GVHD发病率 10 0 %。结论 :胚胎干细胞体外分化为造血干 /祖细胞过程中 ,添加胸腺肽 ,能增加CD+ 3 的成熟T淋巴细胞含量 ,体内重建造血后细胞免疫功能恢复较快。

抗CD4单抗-PAP免疫毒素对T淋巴母细胞样CEM细胞的体外效应

【目的】构建抗CD4单克隆抗体-商陆抗病毒蛋白(PAP)免疫毒素(抗CD4-PAP),分别在体外测定其对T淋巴母细胞样细胞CEM和对照Raji细胞的细胞毒杀伤效应。【方法】以SPDP为交联剂,将纯化的抗CD4单抗与商陆抗病毒蛋白交联成抗CD4-PAP免疫毒素,在体外分别与CEM和Raji细胞进行杀伤试验。【结果】10-9mol/L抗CD4-PAP对CEM细胞产生的细胞毒效应约为60%,而对Raji细胞的细胞毒效应低于10%。抗CD4-PAP免疫毒素在体外对骨髓单个核细胞的CFU无抑制效应,【结论】抗CD4-PAP免疫毒素对T淋巴母细胞样CEM有明显的抑制效应,可能替代抗CD3单抗作为器官移植抗排斥反应及导向免疫治疗T淋巴细胞白血病的临床治疗研究。

定量酶联免疫吸附试验检测各种结缔组织病患者血清中的抗可提取核抗原抗体

目的 定量检测各种结缔组织疾病 (CTD)患者血清中抗可提取核抗原 (ENA)自身抗体滴度 ,并探索其临床意义。方法 自制抗各种ENA单克隆抗体 ,以夹心酶联免疫吸附试验 (ELISA)定量检测 1 2 8例CTD患者、5 0例非CTD患者及 6 0名健康人血清的各种抗ENA自身抗体滴度。用健康人血清各ENA抗体滴度的均数加上 3倍标准差 ( x +3s)为cutoff值 ,界定各种ENA抗体检出率。结果 与健康对照组和非CTD患者组比较 ,抗Sm抗体在系统性红斑狼疮 (SLE)、抗ul RNP抗体在SLE和混合性结缔组织病 (MCTD)、抗SSA和SSB在干燥综合征 (SS)、抗Scl 70抗体在系统性硬化病 (PSS)、抗Jo 1抗体在多发性肌炎 /皮肤炎 (PM/DM)患者中的水平和阳性率都明显升高 (P <0 .0 1 )。结论 定量检测CTD患者血清中各种ENA抗体滴度 ,对CTD疾病的鉴别。

树突状细胞体外诱导抗前列腺癌免疫的研究

【目的】研究树突状细胞(DC)在体外诱导抗前列腺癌的免疫作用。【方法】自前列腺癌患者外周血中分离 CD34+干细胞,加入细胞因子(rhGM-CSF,rhTNF-α及 rhlL-4)培养;以人前列腺癌细胞系 LNCap 细胞的肿瘤相关抗原(TAA)激活 DC;DC 诱导自体 T 淋巴细胞增殖、分化为细胞毒素性 T 细胞(CTL);检测 CTL 对 LNCap 细胞、HepG2细胞、LOVO 细胞及HOS-8603细胞的细胞毒作用。【结果】前列腺癌患者外周血 DC 能够诱导自体 T 淋巴细胞增殖分化为 CTL,该 CTL 对 LNCap细胞有强大的杀伤力(杀伤率为89%±10%,),对 HepG2细胞,LOVO 细胞及 HOS-8603细胞则无明显的细胞毒作用(杀伤率分别为10%±3%,8%±6%,6%±4%)。【结论】前列腺癌患者外周血 DC 体外能够诱导高效而特异抗前列腺癌免疫。提示DC 可能在治疗前列腺癌及预防前列腺癌术后复发和转移中发挥重要作用。

DNA免疫制备抗人CD154单克隆抗体及其轻链可变区基因序列分析

采用pcDNA3 1 hCD15 4重组质粒DNA免疫BALB c小鼠 ,制备抗人CD15 4单克隆抗体 ,得到了能分泌针对人T细胞表面CD15 4分子的特异性单抗的杂交瘤细胞株 (7E8)。通过RT_PCR扩增 7E8单抗轻链可变区基因 ,并对其进行克隆、测序、DNA序列分析和氨基酸推导 ,结果显示轻链可变区基因和氨基酸序列完全符合小鼠Ig轻链的结构特征 ,为制备基因工程抗体并应用于临床打下了基础。

鸡蛋黄免疫球蛋白IgY的特性与用途

1969年Leslic与Clem指出鸟类、爬行类和两栖类动物的蛋黄中仅含有免疫球蛋白IgG一种成分。因为只有免疫球蛋白IgG分子能通过卵黄囊转输至蛋黄中,因此用抗原免疫的母鸡所生的鸡蛋黄中含有丰富的免疫球蛋白IgG。由于鸡蛋黄的英文名称为“Yolk”,特取它的第一个字母“Y”为代表,将鸡蛋黄中的免疫球蛋白IgG称为IgY(Immunoglobulin-Yolk)。

免疫球蛋白IgY的产生及其应用

采用鸡作为免疫宿主可以产生许多有用的多克隆抗体,但至今免疫球蛋白IgY(Immunoglobulinof egg yolk)的产生仍然很少被选用.本文着重介绍一种快速而有效的方法作为亲和层析纯化产生免疫球蛋白IgY的参考.

删除CD4^+CD25^+T细胞对OVA诱导的小鼠体液免疫应答的影响

目的观察删除CD4+CD25+T细胞对OVA免疫小鼠体液免疫应答的影响。方法小鼠腹腔注射抗CD25单克隆抗体,分别于3天、10天、27天采血流式检测外周血中CD4+CD25+T细胞的比例;注射抗CD25单克隆抗体3天后,OVA加铝佐剂免疫未删除和删除CD4+CD25+T细胞小鼠,7天后加强免疫一次,分别于初次免疫后7天,加强免疫后14天采血制备血清,ELISA法检测血清中OVA特异性IgE和IgG1的浓度。结果注射抗CD25单克隆抗体3天和10天,外周血中无CD4+CD25+T细胞;27天后CD4+CD25+T细胞的比例部分恢复。初次免疫7天后,删除CD4+CD25+T细胞小鼠总IgE、OVA特异性IgE和IgG1浓度较未删除组升高;加强免疫14天后,删除CD4+CD25+T细胞小鼠OVA特异性IgE较未删除组升高。结论删除CD4+CD25+T细胞能够影响小鼠OVA特异性体液免疫应答。

未甲基化CpG寡聚脱氧核苷酸对小鼠脾细胞产生免疫球蛋白E的抑制作用

【目的】探讨未甲基化CpG的寡聚脱氧核苷酸(CpG ODN)在体外对小鼠脾细胞和纯化B细胞产生免疫球蛋白E(IgE)的作用及其机制。【方法】在体外,小鼠脾淋巴细胞和纯化B细胞与白细胞介素4(IL-4)+抗CD40单克隆抗体(anti-CD40)在CpG ODN存在或不存在的条件下刺激3d或7d后,用酶联免疫吸附试验法检测IgE的水平,用流式细胞仪检测CD19阳性B细胞的分裂及活化情况。【结果】CpG ODN呈剂量及时间依赖性地抑制由IL-4+anti-CD40诱导的小鼠脾细胞IgE的产生,anti-IFN-γmAb及anti-IL-12mAb不能完全拮抗CpG ODN对IgE产生的抑制作用。同样地,CpG ODN抑制小鼠纯化B细胞IgE的产生。进一步分析结果表明,CpG ODN促进B细胞活化及共刺激分子CD80的表达,但抑制B细胞分裂。【结论】CpGODN直接作用于B细胞而发挥对IgE的抑制作用,该研究为基础和临床研究提供科学理论依据。

血管内皮细胞生长因子在抗结核免疫中的作用及机制

【目的】探讨血管内皮细胞生长因子(VEGF)对巨噬细胞抗结核免疫作用的影响。【方法】为了研究VEGF与结核病(TB)之间的相关性,分离健康人和肺结核病人的外周血单核细胞(PBMC),Real-time PCR检测VEGF的表达水平;体外实验中,用卡介苗(BCG)感染佛波酯(PMA)诱导分化的THP-1细胞,PCR检测VEGF的表达水平。进一步探讨VEGF在抗结核免疫中的作用,分别用BCG单独处理或BCG与VEGF共同处理THP-1诱导分化的细胞,Real-time PCR检测促炎因子TNF-α,IL-6,IFN-γ,MIP-2的表达水平;Griess法检测培养上清中一氧化氮(NO)的产生。【结果】肺结核病人的PBMC中VEGF表达水平相对于健康人明显升高。BCG感染THP-1诱导分化的巨噬细胞后,VEGF表达水平上调;VEGF显著增强BCG感染的巨噬细胞中TNF-α,IL-6,IFN-γ,MIP-2的表达和NO的产生。【结论】肺结核病人的PBMC和BCG感染的巨噬细胞中VEGF表达均显著上调,并可能通过影响促炎因子和NO的产生调节巨噬细胞的抗菌活性,提示VEGF可能是治疗结核病的一个靶点。

HIV gag DNA疫苗诱导小鼠特异性细胞免疫应答的研究

目的研究小鼠注射HIV gag DNA疫苗后的抗原特异性细胞免疫应答。方法C57BL/6小鼠以初免/加强的策略经肌肉注射HIV gag DNA疫苗,一周后获取其脾与肺的单个细胞,体外经Gag抗原多肽刺激后,采用ELISA法检测细胞培养上清中IFN-γ的水平,ELISPOT法检测IFN-γ分泌细胞的频率,流式细胞仪分析特异性T细胞的亚群。结果经Gag多肽刺激后,加强免疫组IFN-γ产生的总体水平和分泌细胞频率均高于对照组及初次免疫组。HIV gag DNA疫苗可同时诱导产生Gag-特异性CD4+和CD8+T细胞。结论HIV gag DNA疫苗免疫小鼠后可诱导抗原特异性效应性T细胞应答。