弓形虫表面抗原SAG3基因和IL-2基因佐剂混合诱导小鼠免疫应答研究

目的了解编码SAG3的重组质粒和IL-2基因佐剂在小鼠体内的免疫反应,为进一步的核酸疫苗及免疫学研究创造条件。方法将编码SAG3的质粒和鼠源性IL-2表达载体以100μg的剂量感染小鼠,3周中两次以相同的剂量加强免疫,分别以PBS和空质粒pcDNA3.1感染。采用ELISA法测定抗体水平、亚型、IFN-γI、L-4和IL-2的含量,RT-PCR方法检测注射部位目的基因的转录,所有鼠均由强毒力ZS2株弓形虫感染。结果SAG3表达质粒3次免疫后鼠体内特异IgG水平明显上升,IL-2表达质粒的联合使用导致IgG2a水平的升高和IFN-γ的产生,提高了其分泌IL-2的水平,但对IL-4的水平产生轻微的影响;RT-PCR显示首次使用导致IgG2a水平的升高和IFN-γ的产生,提高了其分泌IL-2的水平,但对IL-4的水平产生轻微的影响;RT-PCR显示首次免疫15天后,目的基因在肌肉组织中仍有表达;混合质粒注射和小鼠抗弓形虫感染的存活时间延长。结论由SAG3 DNA诱导的免疫应答因IL-2表达质粒的共同注射而增强,DNA疫苗和适当细胞因子的共注射对抵抗弓形虫感染的效果值得进一步研究。

华支睾吸虫囊蚴cDNA表达文库的构建及鉴定

目的 构建华支睾吸虫囊蚴cDNA表达文库,为筛选特异诊断抗原和疫苗候选抗原奠定基础。方法提取华支睾吸虫囊蚴总RNA;用Clontech公司SMARTTM cDNA文库构建试剂盒并按其操作方法进行,进行反转录合成双链cDNA。PCR产物经蛋白酶K消化、纯化后,进行SfiI酶切;用ChromaSpin 400柱将酶切产物进行分级分离,经1.1％琼脂糖凝胶电泳鉴定,回收0.4～4kb的组分,并与λTriplEx2载体连接;连接产物经体外蛋白包装,产生未扩增文库;检测未扩增文库滴度和重组效率后,进行文库的扩增,并测定扩增文库的滴度;随机挑取9个噬菌斑,用载体克隆位点两端的引物进行PCR扩增,以检测所构建的cDNA文库的质量。结果 未扩增文库滴度达7.0×107pfu/ml,扩增文库滴度达2.5×108pfu/ml;用载体两端的引物进行PCR鉴定,结果显示:扩增文库中,含1kb以上的占30％左右,1kb～500bp占69％。结论已成功地获得一高质量的华支睾吸虫囊蚴cDNA表达文库。

华支睾吸虫翻译控制肿瘤蛋白(TCTP)基因的鉴定及其编码区序列克隆

目的 通过cDNA文库筛选识别华支睾吸虫新基因 ,并将所发现的华支睾吸虫翻译控制肿瘤蛋白 (csTCTP)编码区克隆到原核表达质粒PGEX - 4T - 1和真核表达质粒 pcDNA3上 ,为进一步研究其功能奠定基础。 方法 将插入于 pBlue script质粒上的cDNA进行随机测序 ,在NCBI和ExPasy网站上进行序列分析 ,识别华支睾吸虫新基因 ,并应用Motifsan、Scan prosite等程序对其进行结构域分析。根据PGEX - 4T - 1和pcDNA3上的克隆位点及所发现的csTCTPcDNA编码序列设计引物 ,进行PCR扩增 ,扩增产物回收纯化后克隆到原核表达载体PGEX4T - 1和真核表达载体 pcDNA3上。构建的PGEX4T- 1-csTCTP、pcDNA3-csTCTP重组表达质粒经PCR、双酶切及测序证实。 结果 发现华支睾吸虫新基因———csTCTP ,完整阅读框含 5 10个碱基 ,编码 16 9个氨基酸 ,理论分子量为 19 4 5 96Kd。序列分析表明 ,csTCTP编码氨基酸序列与其它物种有较高的同源性 ,Motifscan及Scanprosite程序发现推导的氨基酸序列具有TCTP保守的完整功能域以及两个典型的TCTP完整标签。所构建的重组原核和真核表达质粒经PCR、双酶切及测序证实与目标基因相符。结论 发现华支睾吸虫翻译控制肿瘤蛋白基因 ,并成功构建原核和真核重组表达质粒。

弓形虫膜抗原SAG3基因打靶载体的构建及筛选

目的 构建弓形虫膜抗原SAG3基因打靶载体 ,建立基因敲除突变株 ,为进一步探讨SAG3功能和弓形虫侵入宿主细胞机制提供可行的研究方法。方法 用基因克隆方法将SAG31.5 3kb和 2 .81kb两个同源序列分别插入TUB5 /CAT质粒中 ,构建置换型打靶载体 ,氯霉素乙酰转移酶 (CAT)抗性基因作为筛选标记 ,采用电转移转染细胞方法进行基因打靶 ,建立突变型的弓形虫株 ,采用PCR、酶切分析和SouthernBlot杂交方法筛选鉴定。结果 构建了弓形虫RH株 5’SAG3 TUB5 /CAT 3’SAG3置换型载体 ,获得了敲除SAG3基因的弓形虫突变株 ,建立基因敲除突变株 ,获得了阳性的筛选克隆 ,经鉴定证明基因打靶结果准确。结论 通过构建基因打靶载体 ,可有目的地敲除弓形虫膜抗原基因 ,为进一步研究弓形虫侵入机制 ,探讨弓形虫病防治提供可行的方法。

华支睾吸虫3-磷酸甘油酸激酶基因的扩增、克隆及表达

目的 构建编码华支睾吸虫 3 磷酸甘油酸激酶基因的原核表达载体 ,并分析其在大肠埃希菌中的表达。 方法 用Trizol法从华支睾吸虫 3 成虫体内提取总RNA ,并将其反转录成cDNA。根据华支睾吸虫磷酸甘油酸激酶的已知基因 ,利用DNAclub和PCRdesign软件设计合成一对特异引物 ,从合成的cDNA中 ,用PCR技术扩增出目的片段。将目的片段和原核表达载体同时双酶切后连接 ,重组体转入JM10 9大肠埃希菌 ,用双酶切、PCR和测序筛选阳性克隆。挑选 1个阳性菌落 ,用异丙基 β D 硫代半乳糖苷诱导表达 ,表达产物进行十二烷基硫酸钠 聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS PAGE)鉴定。 结果 用逆转录 聚合酶链反应技术扩增出 1条 12 48bp大小的片段 ,PCR产物测序鉴定正确 ;转化后得到 10个克隆 ,双酶切、PCR扩增鉴定 ,其中 6个为阳性克隆 ;表达产物用SDS PAGE鉴定 ,在相对分子质量 70 0 0 0处有 1条与理论预测的融合蛋白大小相一致的特异条带。 结论 成功构建重组原核表达载体pGEX 4T 1 PGK 。

华支睾吸虫cDNA表达文库的构建及初步筛选

目的 构建华支睾吸虫cDNA表达文库 ,为筛选特异诊断抗原和疫苗候选抗原奠定基础。 方法 提取华支睾吸虫总RNA ;用Clontech公司SMARTTMcDNA文库构建试剂盒操作方法 ,进行反转录合成双链cDNA ;PCR产物纯化后 ,进行SfiI酶切 ;用ChromaSpin 40 0柱将酶切产物进行分级分离 ,回收 0 .4～ 4kb的组分 ,并与λTriplEx2载体连接、体外蛋白包装 ,产生未扩增文库 ;检测未扩增文库滴度和重组效率后 ,进行文库的扩增 ,并测定扩增文库的滴度及鉴定。 结果 未扩增文库滴度达 7.5× 10 7pfu/ml ,扩增文库滴度达 2 .7× 10 8pfu/ml ;用载体两端的引物进行PCR鉴定 ,显示 :所选噬菌体中均含有重组的cDNA ,大小在 5 0 0bp以上。 结论 已成功地获得一高质量的华支睾吸虫cD

广州管圆线虫成虫cDNA文库构建

目的 构建广州管圆线虫成虫cDNA文库。方法 提取广州管圆线虫成虫总RNA ,用Clontech公司SMARTTMcDNA文库构建试剂盒反转录合成第一链cDNA ,然后通过长距离PCR方法合成双链cDNA并扩增 ;PCR产物与λTripIE× 2载体连接并包装 ,建成未扩增文库 ;检测未扩增文库滴度和重组效率后 ,进行文库扩增及测定扩增文库的滴度。结果 经测定 ,未扩增文库滴度为 9 7× 1 0 6 pfu/ml,重组效率达 99 2 %以上 ,文库扩增后滴度达 9 1 3× 1 0 9pfu/ml。

华支睾吸虫3-磷酸甘油醛脱氢酶基因的克隆、表达和序列分析

目的 通过筛选华支睾吸虫成虫 cDNA质粒文库,寻找、识别新基因,并将其编码区克隆到原核表达质粒pGEX 4T 1中,表达出融合蛋白,为进一步研究其功能奠定基础。 方法 用文库通用引物对华支睾吸虫 cDNA 质粒文库进行PCR扩增,对产物为500 bp以上的质粒进行测序,测序结果在NCBI 和ExPasy 网站上进行序列分析,识别华支睾吸虫新基因,并应用ORFfind、ClustalW、NCBI Conserved Domain Search等程序对其进行开放阅读框、进化树及结构域分析。根据 pGEX 4T 1上的多克隆位点及所发现的新基因cDNA 编码序列设计引物,进行PCR 扩增,扩增产物回收纯化后克隆到原核表达载体 pGEX 4T 1 上。构建的重组表达质粒经 PCR、双酶切及测序鉴定,并对鉴定过的重组体进行诱导表达,表达产物经SDS PAGE电泳鉴定。 结果 发现CsGAPDH基因,完整阅读框含1 017 个碱基对,编码339 个氨基酸,理论分子质量单位为37.024 09 ku ,理论pI为6.66 。序列分析显示,CsGAPDH与曼氏血吸虫GAPDH的同源性为78%,具有GAPDH保守功能域。所构建的重组原核表达质粒经PCR、双酶切及测序鉴定与目标基因相符。SDS PAGE电泳显示表达产物在63 ku处有1条特异性条带。 结论 发现华支睾吸虫 GAPDH基因,成功构建重组原核表达质粒并表达出融合蛋白。

临床实习学生SARS感染流行病学分析

目的 了解临床实习学生感染SARS的情况 ,为做好今后的防治工作提供依据。方法 采用整群抽样和流行病学个案调查 ,对中山大学临床医学各年级本科生进行回顾性调查 ;对患过SARS病的 9名学生以及与他们密切接触的 2 0名学生进行SARS病毒特异性IgG抗体检测。 结果 在 2 3 7名实习学生中 ,有 10人罹患SARS ,患病率为 4 2 2 %。参与“抗非典”一线医疗工作的有 2 0人 ,其中 6人感染SARS ,患病率为 3 0 0 % ;在医院实习或见习 ,但未参与“抗非典”一线医疗工作有 2 17名 ,其中 4人感染SARS ,患病率为 1 84%。结论 临床实习学生是SARS的高危人群 ,应积极做好防护工作 。

日本血吸虫肺期童虫收集方法的实验研究

目的建立一种收集纯净肺期童虫的方法。方法用日本血吸虫尾蚴感染昆明小鼠,分别于感染后第1、2、3、4、5、6、7、10、12、14、21天解剖,从皮肤、肺脏、肠系膜静脉及肝门静脉处收集童虫。结果肺期童虫出现的高峰期为感染后第3天,获得最佳收获肺期童虫的时间,建立了回收大量纯净童虫的方法。

华支睾吸虫乙醛脱氢酶基因的克隆、表达和序列分析

【目的】通过筛选华支睾吸虫成虫cDNA质粒文库,发现并识别新基因,将发现的新基因编码区克隆到原核表达质粒pGEX鄄4T鄄1并表达出融合蛋白。【方法】用文库通用引物对华支睾吸虫cDNA质粒文库进行PCR扩增,对产物为500bp以上的质粒测序,结果在NCBI和ExPasy网站上进行序列分析,并应用ORFfind、ClustalW、NCBIConservedDomainSearch等程序对其进行开放阅读框(ORF)、进化树及结构域分析。根据载体多克隆位点及新基因ORF设计引物,PCR扩增,产物克隆到目的载体上。筛选并鉴定出阳性克隆,对鉴定过的重组体进行诱导表达,表达产物经SDS鄄PAGE电泳鉴定。【结果】发现CsALDH基因,完整阅读框含1467个碱基,编码489个氨基酸,理论相对分子质量Mr≈52.564×103,理论pI为5.43。序列分析表明,CsALDH基因编码的氨基酸序列与其它物种有较高的同源性,CsALDH与爪蛙属乙醛脱氢酶的同源性为59%,具有乙醛脱氢酶保守功能域。构建的重组原核表达质粒经鉴定与目标基因相符。电泳显示表达产物在Mr≈78×103处有一条特异性条带。【结论】发现华支睾吸虫磷酸甘油醛脱氢酶基因,成功构建重组原核表达质粒并表达出融合蛋白。

恶性疟原虫海南株端粒酶催化亚基基因的克隆及序列分析

目的 克隆恶性疟原虫端粒酶基因 ,为今后筛选抗疟药物提供理论依据。方法 根据四膜虫的端粒酶基因序列 ,设计并合成一对引物 ,从恶性疟原虫基因组DNA中扩增出端粒酶基因 ,进行测序及利用生物信息学技术对端粒酶基因进行了分析。结果 得到了 2 3kp的恶性疟原虫海南株端粒酶基因。结论 恶性疟原虫端粒酶基因的克隆 。

恙虫病东方体Karp株Sta56基因的克隆及序列比较的研究

目的扩增恙虫病东方体Karp株主要表膜抗原Sta56的开放读码框(ORF)全长,并进行序列比较研究。方法小鼠接种传代和体外细胞扩增分离恙虫病东方体Karp株,用PCR方法扩增恙虫病东方体Karp株Sta56基因,并采用TA克隆技术构建测序载体,对测序结果进行同源性分析比较。结果 扩增出Sta56的ORF全长,并TA克隆到测序载体pMD18-T vector,测序结果与Karp标准株的同源性为99.4％。结论 Sta56全长ORF克隆扩增成功,为进一步构建表达载体,进行Sta56蛋白表达研究提供基础。

人源性抗腮腺炎病毒噬菌体抗体库的构建

应用噬菌体表面呈现技术,从腮腺炎病毒抗体阳性者淋巴细胞中提取总RNA,经RT-PCR扩增出抗体重链Fd和轻链基因,经XhoI/SpeI、SacI/XbaI双酶切,先后克隆入噬粒载体pComb3中,再电转化大肠杆菌XL1-blue,以辅助噬菌体VCSM13进行超感染。从分离出的淋巴细胞中共提取高质量RNA约110μg,经逆转录、PCR,分别扩增出约700 bp大小的κ、λ和Fd基因。PCR产物和载体经纯化、双酶切后进行连接,在2.5 kV、200 Ω、25μF的条件下电转化,转化率为2.48×107。最终得到库容量为6.4×106,滴度为7.8×1013 cfu/L的噬菌体抗体库。所构建的抗腮腺炎病毒特异性噬菌体抗体库容量中等大小,能满足从中筛选抗HN蛋白噬菌体抗体的需要。

抗华支睾吸虫CAg噬菌体抗体表达与活性鉴定

目的 对从抗华支睾吸虫噬菌体抗体库中筛选到的阳性克隆进行诱导表达和鉴定。方法 对阳性克隆株B0 5、C10和E38用异丙基 - β -D -硫代半乳糖苷 (IPTG)诱导表达 ,经SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS -PAGE)和蛋白印迹试验 (Westernblot)观察有无Fab抗体条带。然后 ,用卫氏并殖吸虫 (Pw)、肝片吸虫 (Fh)、姜片吸虫 (Fb)、华支睾吸虫 (Cs)、日本血吸虫 (Sj)脱脂全虫粗抗原和华支睾吸虫代谢抗原 (Cs-MAg)进行SDS -PAGE ,并分别和B0 5、C10和E38噬菌体抗体进行Westernblot,鉴定抗体活性。结果 Westernblot结果表明 ,3株阳性克隆的培养上清和细菌冻融上清在约 5 0kD和 2 7kD处均有特异抗体条带出现。B0 5噬菌体抗体与Cs-MAg和Cs-Ag在约 2 5kD处出现特异性反应条带 ,而与其它 4种吸虫抗原无反应条带的出现。C10除与Cs-MAg和华支睾吸虫全虫抗原 (Cs -Ag)在约 38kD处出现反应条带外 ,还与Sj-Ag在该处有弱阳性反应 ;而与其它 3种吸虫抗原无反应条带出现。E38与Cs-MAg和Cs-Ag在约 16kD处出现特异性反应条带 ,而与其它 4种吸虫抗原无反应条带出现。 结论 3株阳性克隆均可表达抗华支睾吸虫循环抗原 (CAg)噬菌体抗体 ,其中B0 5和E38具有特异结合Cs-CAg活性。

DNA改组及其应用

DNA改组是一种改造基因和蛋白的有效实验进化技术。DNA改组技术在医药、疫苗、农业、生物治疗、兽药研究、营养、人类基因治疗、生物武器的研究等重要领域都具有广阔的应用开发前景。

端粒酶突变体对肝癌细胞端粒酶活性的作用

目的 观察端粒酶突变体对肝癌细胞端粒酶活性和生长抑制的作用。方法 利用质脂体转染法在培养的肝癌细胞中导入端粒酶突变体 ,并与维甲酸和人参皂甙对照 ,利用TRAP 银染方法对不同时期肝癌细胞进行了端粒酶活性的测定 ,并观察各期细胞生长情况。结果 在加入端粒酶突变体后肝癌细胞端粒酶活性明显降低 ,细胞出现明显凋亡现象 ,其作用效果与维甲酸基本相同。结论 端粒酶突变体对肝癌细胞的抑制作用可能是通过抑制端粒酶活性途径实现的。

P43基因在造血干细胞移植患者弓形虫感染诊断中的应用

目的建立快速、特异、敏感诊断造血干细胞移植(HSCT)患者弓形虫感染情况的DNA检测方法,并讨论其临床意义。方法利用ELISA和PCR方法对56例造血干细胞移植受者及20例正常供者同时进行检测。结果检测造血干细胞移植受者56例,PCR和ELISA方法检测弓形虫P43基因片段和其抗原,阳性各为10及7例;其阳性率分别为17.86％和14.3％。作为阴性对照的20名正常者同时进行弓形虫的检测,其结果均为阴性。结论体外扩增弓形虫P43基因的方法具有准确、快速、特异和敏感的优点,可以作为造血干细胞移植患者弓形虫感染诊断的有价值的方法之一。