病理性瘢痕与正常皮肤的蛋白质组学研究

目的:通过比较病理性瘢痕与正常皮肤组织的蛋白质组表达差异,寻找和筛选出病理性瘢痕形成机制中的特异蛋白质。方法:运用蛋白质组学技术,对8例瘢痕疙瘩、8例增生性瘢痕患者的组织和3例正常皮肤组织进行差异双向电泳(2D-DIGE),选择差异蛋白质斑点,进行MALDI-TOF/TOF质谱分析和生物信息学分析。结果:成功建立病理性瘢痕和正常皮肤组织的双向凝胶电泳图谱,瘢痕疙瘩、增生性瘢痕和正常皮肤组织凝胶电泳图谱中平均蛋白质斑点数分别为2 978、2 975和3 053。与正常皮肤组织相比,我们对瘢痕疙瘩和增生性瘢痕中差异超过4倍的斑点进行质谱分析和数据库检索,共鉴定出36种不同蛋白,包括:瘢痕疙瘩和增生性瘢痕表达相同的16种蛋白,其中上调蛋白8种,下调蛋白8种;只在瘢痕疙瘩中表达的有11种不同蛋白,其中上调9种,下调2种;只在增生性瘢痕中表达的有9种不同蛋白,其中上调4种,下调5种。结论:蛋白质组学较好地显示了病理性瘢痕与正常皮肤组织间的蛋白质表达差异;进一步研究鉴定出的差异蛋白质,有可能对揭示病理性瘢痕形成机制提供新的思路。

运用蛋白质组学技术研究结肠黏膜、腺瘤及腺癌组织蛋白的差异表达

【目的】通过比较结肠正常黏膜、腺瘤、腺癌组织之间的蛋白质组表达差异,寻找结肠腺癌相关的蛋白质,筛选结肠癌早期诊断的分子标志物。【方法】运用比较蛋白质组学技术,对8例结肠癌患者(伴有腺瘤)的正常黏膜、腺瘤、腺癌组织提取的总蛋白进行双向电泳(2-D),分析凝胶图片选择两两间差异表达超过2倍的蛋白质进行MALDI-TOF/TOF质谱分析和生物学信息分析。【结果】成功建立结肠正常粘膜、腺瘤、腺癌的双向凝胶电泳图谱,在凝胶电泳图谱中平均蛋白质斑点数分别为3066、2986和3289,其中两两间表达差异超过2倍的斑点共有31个,质谱分析和数据库检索共鉴定出18种蛋白质,包括keratin8、S100A6、protein disulfide isomerase等。从功能分析,这些差异蛋白与癌细胞的发生、增殖、分化、转移等相关。【结论】比较蛋白质组学能较好地提示结肠腺癌与腺瘤及正常组织间的蛋白质表达差异,而对相关差异表达蛋白的研究有可能为结肠癌的早期诊断和治疗提供新的分子靶向。

乙腈预处理血清寻找肝细胞癌发病相关的蛋白质

【目的】应用乙腈(ACN)预处理血清的方法,对肝细胞癌(HCC)患者的血清进行蛋白质组分析,寻找与HCC发病相关的蛋白质。【方法】收集原发性HCC患者和健康人的血清各12例,首先使用乙腈预处理,然后去除白蛋白和免疫球蛋白等高丰度蛋白质,再进行双向电泳(2-DE)分析,筛选HCC与健康对照血清中有显著性差异的蛋白质斑点,并进行MALDI-TOF/TOF质谱鉴定。【结果】血清经0%、20%和30%浓度的乙腈预处理后,进行2-DE分析发现蛋白质斑点的检出数量分别为532±96、623±102和674±123;对预处理后HCC患者和正常人的血清进行差异分析,发现甲状腺素(Tetraiodo-L-Thyronine)和Proapolipoprotein的表达上调,而维生素D结合蛋白(Vitamin D-binding Protein)和铁传递蛋白(Transferrin)的表达下调。【结论】对血清样本的蛋白质组分析,应用乙腈预处理会增加与白蛋白非特异性结合的蛋白质的检出;HCC患者血清中甲状腺素等4个蛋白的表达异常与HCC相关。

利用蛋白质组学技术筛选不同中医证型的寻常型银屑病血浆的相关蛋白

目的:研究不同中医证型寻常型银屑病患者血浆的差异表达蛋白,筛选不同中医证型寻常型银屑病患者血浆的特异性蛋白质标记物。方法:收集寻常型银屑病30例(其中血热证、血瘀证、血燥证各10例)、健康人10名的外周血浆,应用双向电泳/基质辅助激光解析电离飞行时间质谱联用技术(MALDI-TOF-MS)技术,检测血浆的蛋白峰值。结果:寻常型银屑病组与健康对照组间差异蛋白点为2个,差异蛋白峰为4 964.42和6 630.68;血热证患者与血瘀证患者之间差异蛋白点为1个,差异蛋白峰为2 661.29,血热证患者与血燥证患者之间差异蛋白点为2个,差异蛋白峰为6 432.69和6 630.87,血瘀证患者与血燥证患者之间差异蛋白点为4个,差异蛋白峰为3 241.60、1 945.18、6 631.49和4 418.77。结论:寻常型银屑病组和健康对照组以及银屑病不同中医证型间血浆蛋白表达谱存在差异,可能与银屑病的发病机制以及各证型的微观物质基础有关。

人膝骨关节炎血清生物学标志物的筛选

目的:比较膝骨关节炎患者与正常人血清蛋白质组的差异,筛选其能用于骨关节炎诊断、治疗或发病机制研究的血清生物学标志物。方法:利用双向荧光差异凝胶电泳技术比较膝骨关节炎患者血清(4例)与健康志愿者血清(4例)蛋白图谱的差异,使用基质辅助激光解吸电离-飞行时间质谱及生物信息学相关技术对获得的差异蛋白进行鉴定和初步分析,并用Western blotting进一步验证所鉴定的蛋白。结果:成功建立了骨关节炎血清差异蛋白质组学的研究方法;通过质谱分析初步鉴定出8个差异蛋白,其中5个蛋白在膝骨关节炎组表达上调,3个蛋白在膝骨关节炎组表达下调。Western blotting进一步验证得到α2-巨球蛋白在膝骨关节炎组表达上调,与双向荧光胶内差异凝胶电泳技术联合质谱分析的结果一致。结论:膝骨关节炎患者血清与正常人血清蛋白表达存在明显差异,其中α2-巨球蛋白可作为骨关节炎潜在的疾病相关生物学标志物进一步研究,为骨关节炎的诊断、治疗和发病机制的研究提供新的线索和实验基础。

超高效液相色谱-串联质谱法测定小鼠纹状体中多巴胺及其代谢物的含量

提出了超高效液相色谱-串联质谱法同时测定小鼠纹状体中多巴胺(DA)及其代谢物高原儿茶酸(DOPAC)与高香草酸(HVA)含量的方法。取小鼠纹状体约10 mg,用200μL 2%(体积分数)甲酸溶液提取、离心。取上清液80μL,加入40μg·L^(-1)异丙肾上腺素(内标)溶液10μL和含0.1%(体积分数,下同)乙酸的甲醇溶液10μL,涡旋混匀,再加入100μL甲醇,涡旋、离心。上清液中DA及其代谢物在Gemini NX-C_(18)色谱柱上分离,以不同体积比的0.1%乙酸溶液和含0.1%乙酸的甲醇溶液混合液为流动相进行梯度洗脱,质谱分析采用电喷雾离子源正、负离子模式,选择反应监测(SRM)模式扫描。结果表明,3种目标物在7.00 min内能完成测定。DA、DOPAC和HVA标准曲线的线性范围分别为0.05~100,0.5~1000,0.25~500μg·L^(-1),检出限分别为0.015,0.150,0.075μg·L^(-1)。按照标准加入法进行回收试验,回收率为84.4%~117%,日内精密度和日间精密度试验所得测定值的相对标准偏差均小于15%。质控样品在自动进样器中保存8 h、4℃保存24 h以及-80℃保存30 d前后3种目标物测定值的相对误差绝对值不大于20%,说明样品稳定性良好。

表达纯化糖原合成酶激酶3β的两种方法比较

目的建立一套高纯度、高活性表达糖原合成酶激酶3β的技术。方法分别采用大肠杆菌和杆状病毒昆虫细胞蛋白表达系统表达糖原合成酶激酶3β,通过His和GST标签两步纯化目的蛋白,SDS-PAGE观察目的蛋白的纯度,激酶反应观察目的蛋白的活性。结果大肠杆菌表达纯化的糖原合成酶激酶3β占纯化后总蛋白的量为54%,昆虫细胞表达纯化的糖原合成酶激酶3β占纯化后总蛋白的量为96%;昆虫细胞来源的目的蛋白比大肠杆菌来源的目的蛋白活性高一倍左右。结论相比大肠杆菌表达的糖原合成酶激酶3β,昆虫细胞表达的目的蛋白具有更高的纯度和活性。