人脐血T/NK细胞KIR分子表达的初步探讨

【目的】探讨脐血中T淋巴细胞和自然杀伤 (NK)细胞上杀伤性抑制性受体 (KIR)的表达特性。【方法】采用流式细胞仪检测 2 6份正常分娩新生儿脐血的T/NK细胞表面KIR分子表达 (CD15 8a,CD15 8b和CD94) ,并与正常外周血比较。【结果】脐血中T淋巴细胞和NK细胞均存在KIR分子表达 ;脐血和外周血中T淋巴细胞CD15 8分子表达低于NK细胞 (P<0 0 5 ) ,脐血T淋巴细胞亚群中CD15 8分子表达低于正常外周血 ;CD15 8几乎不表达于CD4+ T细胞 ,主要表达于CD8+ T细胞 ,且以CD15 8a+ 为主 ;脐血中NK细胞CD15 8分子表达高于T淋巴细胞 (P <0 0 5 ) ,但明显低于外周血NK细胞KIR表达 (P <0 0 1) ;脐血和外周血CD4+ T细胞上CD94+ 表达无差异 (P >0 0 5 ) ,但脐血CD8+ T细胞和NK细胞CD94+ 表达则明显低于外周血 (P <0 0 1)。

高效液相色谱法测定人子宫、输卵管及血清中氧氟沙星浓度

目的 建立人组织及血清中氧氟沙星含量的HPLC测定方法。方法 采用HypersilC1 8柱分离 ,流动相为乙腈 0 0 1moL·L- 1 磷酸盐缓冲液 0 5moL·L- 1 四丁基溴化铵 (9∶91∶4 ,pH 2 5 ) ,流速 1 0mL·min- 1 ,在UV 2 94nm处测定 ;样品经匀浆或用液氮冷冻研磨至粉末状 ,用 1%曲拉通 10 0溶解 ,乙酸乙酯 异丙醇 (9∶1)提取 ,HPLC测定。结果氧氟沙星浓度在 0 2～ 8 0 μg·mL- 1 与峰高比呈线性关系 ,最小检测限 4 0ng·mL- 1 ,用本法对 2 0例妇产科病人进行药物浓度测定 ,取得了满意的结果。结论 此方法适用于人体组织中氧氟沙星浓度的测定 。

脐血B淋巴细胞的免疫表型及临床意义

目的分析脐血 B淋巴细胞 ( B细胞 )的免疫表型及其临床意义。方法直接免疫荧光标记 ,流式细胞仪检测并对比研究 2 6例正常足月儿脐血和 15例正常成人外周血 B细胞相关表型表达。结果足月儿脐血中成熟 B细胞表型 CD19+ ,CD2 0 + CD19+ ,CD2 2 + CD19+ ,CD2 3 + CD19+ ,CD4 0 + CD19+ 的表达以及不成熟 B细胞表型 CD10 + CD19+ ,CD5 + CD19+ 的表达 ,除 CD2 3 + CD19+ 和 CD4 0 + CD19+ 外 ,均比正常人外周血高 ( P<0 .0 5 ) ,并且无性别之间差异 ( P>0 .0 5 )。结论与成人外周血比较脐血

化疗对卵巢癌患者细胞免疫功能的影响

目的 观察化疗前后卵巢癌患者外周血T淋巴细胞亚群和NK细胞的变化 ,探讨化疗对患者的免疫损伤情况。方法 用流式细胞仪检测患者化疗前后外周血T淋巴细胞亚群和NK细胞的百分率。结果 与正常人比较 ,不论化疗前或化疗后 ,各指标均显著下降 ,有统计学意义。化疗后与化疗前比较 ,CD+ 4细胞和NK细胞明显下降 ,差异有统计学意义 ,CD+ 8细胞在前两个疗程变化不明显 ,第 3疗程下降明显 ,有统计学意义 ,后三个疗程变化虽没有统计学意义 ,但有下降趋势。CD+ 4/CD+ 8比值在第 3疗程比化疗前升高 ,其它 5个疗程均有下降 ,均有统计学意义。结论 卵巢癌患者免疫状态比正常人低 ,化疗对患者免疫功能的影响主要是对CD+ 4细胞和NK细胞的损伤 。

系统性红斑狼疮患者B淋巴细胞EBV-LMP1和ZEBRA的表达研究

目的：探讨ＥＢＶ－ＬＭＰ１和ＺＥＢＲＡ在系统性红斑狼疮患者（ＳＬＥ）的表达情况。方法：间接荧光免疫标记，流式细胞仪检测。结果：ＳＬＥ患者Ｂ淋巴细胞中ＥＢＶ－ＬＭＰ１和ＺＥＢＲＡ的表达显著高于正常对照组（Ｐ＜０．０１）。活动期患者ＣＤ２３＋细胞ＥＢＶ－ＬＭＰ１和ＺＥＢＲＡ的表达率均高于ＣＤ１９＋细胞（Ｐ＜０．０１）。非活动期患者ＣＤ２３＋细胞ＥＢＶ－ＬＭＰ１表达也高于ＣＤ１９＋细胞（Ｐ＜０．０１）。但ＥＢＶ－ＺＥＢＲＡ表达在两亚群间差异没有统计学意义（Ｐ＞０．０５）。结论：朋病毒参与了ＳＬＥ的发病机制，病毒主要以潜伏期状态存在于患者中，病毒复制促进病情发展，检测Ｂ淋巴细胞ＥＢＶ－ＬＭＰ１和ＺＥＢＲＡ的表达率，有助于病情活动指标的判断。

RNA-蛋白质印迹筛选HBsAg转录后调节因子表达克隆

RNA结合蛋白是基因表达的重要调节因子.RNA蛋白质印迹(Northwesternblot)是近年来国外建立的筛选这类因子的重要方法之一.应用这一方法从肝细胞株HepG2cDNA文库中成功筛选到乙型肝炎病毒表面抗原转录后调节片段互相作用蛋白表达克隆.结果显示:该蛋白与探针结合特异性强,经三轮筛选后,100%克隆为阳性克隆;PCR和EcoRⅠ酶切初步鉴定,编码该蛋白的cDNA长约1kb.

NS5B与HCV负链RNA3′末端特异性结合的分析

NS5B是RNA依赖性RNA聚合酶 ,在病毒RNA合成过程中起到中心催化酶的作用 .在大肠杆菌中表达和提纯了GST NS5B融合蛋白 ,应用紫外交联试验 (UVcross linking)检测NS5B与丙型肝炎病毒 (HCV)负链RNA 3′末端的结合 ,确定NS5B是否参与HCV负链RNA 3′末端复制体的形成 .NS5B可与HCV负链RNA 3′末端发生结合 ,这种结合存在量效关系 ,比与正链RNA 3′UTRX区的结合强约 10倍 ,超大量的非同源性RNA和蛋白质不能竞争抑制NS5B与负链RNA 3′末端的结合 ,证明这种结合存在特异性 .结果提示NS5B是HCV负链RNA 3′末端复制体的成分之一 .

形成丙型肝炎病毒负链复制体的相关蛋白的分析

【目的】确定丙型肝炎病毒 (HCV)非结构蛋白NS5B以及肝母细胞瘤株HepG2胞浆提取物中的宿主蛋白与HCV负链RNA 3′末端的特异性结合作用。【方法】用蛋白 核酸紫外交联试验分别检测NS5B以及HepG2胞浆提取物中的宿主蛋白与HCV负链RNA 3′末端的结合作用 ,用非同源RNA和非同源蛋白作为竞争物分析这种结合的特异性。【结果】NS5B以及宿主细胞内一约 4 5ku的蛋白质 (简称P4 5 )均可与HCV负链RNA 3′末端特异性结合。【结论】NS5B和P4 5是HCV负链RNA

慢性乙型肝炎患者外周血树突细胞的体外扩增及鉴定

目的 尝试从慢性乙型肝炎患者外周血扩增培养出大量树突细胞 ,为进一步临床应用树突细胞治疗慢性乙型肝炎提供物质基础。方法 分别取健康人和患者外周血分离培养单核细胞 ,加入rhGM CSF、rhIL 4,经 7天培养后收获即为不完全成熟树突细胞 (DC)。以倒置显微镜观察摄影、透射电镜摄影、流式细胞仪测定表面特异性分子的表达、混合淋巴细胞反应测定功能 ,对DC进行鉴定。结果 第七天记数有明显树突状突起的大个细胞或细胞团 ,产率为 0 2～ 4 5× 10 5/6ml血 ;透射电镜可见细胞表面伸展的突起 ;70 %以上细胞有DC特异性标志CD1a高表达 ,而单核细胞特异性标志CD14表达小于 4% ;能刺激同种异体淋巴细胞强烈增殖 ,随刺激细胞数目的增加 ,其促增殖作用增强 ,P <0 0 1。结论 在本实验条件下 ,从慢性乙型肝炎患者外周血单核细胞可诱导扩增出大量DC。

胃癌中MTS1基因异常甲基化的研究

【目的】探讨多肿瘤抑制基因 (multipletumorsuppressorgene 1,MTS1) 5′端CpG岛异常甲基化与原发性胃癌发病机制之间的关系。【方法】PCR 甲基化检测法研究 31例胃癌标本和 19例正常胃组织中MTS1基因 5′端CpG岛异常甲基化情况。【结果】有 35 5 % (11/ 31)的胃癌标本和 5 3 % (1/ 19)正常胃组织出现MTS1基因 5′端CpG岛异常甲基化 ,两者之间有显著性差异 (P <0 0 5 )。【结论】MTS1基因 5′端CpG岛异常甲基化是其在原发性胃癌中的主要灭活机制 ,与胃癌的发生发展密切相关。

野生型p53基因对人卵巢癌细胞株的生长抑制作用

目的：探讨野生型ｐ５３(ｗｔ ｐ５３)基因对人卵巢癌细胞株的生长抑制作用。方法：利用脂质体介导，将含有人全长ｗｔ－ｐ５３基因ｃＤＮＡ的真核表达载体质粒ｐＣＥＰ４／ｐ５３和空载体质粒ｐＣＥＰ４分别转染卵巢癌ＳＫＯＶ３细胞株，分别命名为ＳＫＯＶ３－ｐＣＥＰ４／ｐ５３细胞(C组)、ＳＫＯＶ３－ｐＣＥＰ４细胞(B组)，另设ＳＫＯＶ３细胞为正常对照组（Ａ组）。观察细胞体外生长情况和凋亡变化。结果：外源性ｐ５３基因在Ｃ组细胞中获表达，细胞生长曲线显示ｐ５３的导入使ＳＫＯＶ３细胞生长受到明显抑制，Ｃ组平均细胞集落数（１８．６±１．８个）少于Ａ组（２４．３±２．２个）和Ｂ组（２２．７±２．６），差异有显著性（Ｐ（005）。ＭＴＴ法检测C组细胞活力明显低于Ａ、Ｂ组。Ｃ组细胞Ｇ０～Ｇ１期百分比（５７．７９％）及凋亡细胞百分比（13．９1％）均高于Ｂ组（４６．０２％、２．０８％）和Ａ组（４３．６２％、０）。结论：ｗｔ－ｐ５３基因可介导ＳＫＯＶ３细胞Ｇ１期停滞和细胞凋亡，抑制细胞体外生长。

充血性心力衰竭犬心肌诱生型一氧化氮合酶的表达

【目的】观察诱生型一氧化氮合酶 (iNOS)在充血性心力衰竭犬动物模型心肌组织中的表达。【方法】建立快速心脏起搏致心力衰竭的动物模型 ,用RT PCR方法观察心力衰竭不同阶段心肌组织iNOSmRNA的表达。【结果】在快速心脏起搏致心力衰竭动物模型的不同阶段 ,心肌细胞均有iNOSmRNA的表达 ,表达的水平在起搏的第 1周末即达到高峰 ,第 2周末有所回落并在第 3周末维持在较稳定的水平 ,而在第 4周末则出现了明显的衰退。【结论】心肌组织iNOS的生成参与快速心脏起搏致心力衰竭犬模型心力衰竭的形成过程。

与丙型肝炎病毒复制中间体3′末端结合的宿主蛋白的研究

宿主细胞蛋白在HCV复制过程中起着重要的作用 .应用蛋白质 核酸紫外交联法检测多个细胞株 ,目的是明确是否存在可与HCV复制中间体 3′末端特异性结合的细胞蛋白质 .结果显示 ,在多个细胞株中存在一个分子质量约为 45ku的蛋白质 (命名为 p45 ) ,可与HCV复制中间体 3′末端 131～ 2 78nt结合 ,这种结合可被过量的自身未标记RNA竞争抑制 ,而非同源蛋白和非同源RNA均不能竞争抑制这种结合 .根据计算机RNA二级结构分析推测 ,p45可能特异性结合于HCV复制中间体 3′端的一茎环结构内 .这一结果提示 ,p45在HCV子代RNA复制中可能起着重要作用 .

经树突状细胞递呈的HBcAg特异性细胞毒T淋巴细胞的体外研究

目的 从人的外周血树突状细胞 (DC)的抗原递呈方面研究慢性乙型肝炎的发病机制 ,并诱导出针对HBcAg特异性的细胞毒T淋巴细胞 (CTL)。方法 取健康人DC和患者DC ,比较两组的抗原递呈功能是否存在差异。以HBcAg体外冲击致敏DC ,与自体T淋巴细胞共育 ,诱导出HBcAg特异性CTL ;以HepG2细胞为对照靶细胞 ,转染HBVDNA的HepG2 2 15细胞为靶细胞 ,分别测定CTL在效靶比为 2∶1、6∶1和 2 0∶1时对HepG2细胞的非特异性杀伤率及对HepG2 2 15细胞的特异性杀伤率 ,并比较患者组与正常组特异性杀伤率的差异。结果 患者DC的抗原递呈功能(10 99.2 6 7± 2 39.12 ,1374 .8± 36 4 .15 5 ,2 717.78± 15 89.72 )较健康人 (314 7.933± 72 6 .5 7,384 3.0 0 0±10 6 0 .85 ,5 4 86 .86 7± 1790 .6 4 )弱 ;健康组与患者组CTL对HepG2各效靶比的非特异性杀伤作用差异无显著性。健康组与患者组CTL对HepG2 2 15的特异性杀伤作用差异有显著性 ;患者组CTL的活性 (7.1± 4 .33,15 .6 8± 3.3,2 7.6 6± 4 .5 9)较健康组 (2 0 .76± 6 .0 8,33.97± 8.0 0 ,4 9.6 3± 9.4 8)弱。结论 用HBcAg体外负载患者DC ,能诱导出抗原特异性的CTL ,这些CTL能特异性地杀伤相应靶细胞。

PIP融合蛋白在大肠杆菌中的表达纯化及其与PRE特异性的结合

目的 表达纯化PIP融合蛋白 ,探讨研究PIP与PRE特异性结合的方法。方法 构建GST PIP融合蛋白表达质粒pGENKS PIP ,表达质粒在大肠杆菌BL2 1中诱导表达GST PIP融合蛋白 ,并用亲和层析柱加以纯化。利用这一融合蛋白通过Northwesternblot、UV crosslinking方法研究PIP与PRE的特异性结合。结果 GST PIP融合蛋白表达质粒pGENKS PIP在大肠杆菌BL2 1中成功地诱导表达了可溶性GST PIP融合蛋白 ,纯化后获得了单一的GST PIP融合蛋白。Northwesternblot和UV crosslinking证实PIP与PRE特异性结合。比较两种方法 ,前者较后者特异性高 ,灵敏度低 ,而后者操作简便。结论 表达和获得纯化的PIP融合蛋白 。