机会致病寄生原虫的系列研究

本课题包括：①对机会致病寄生虫，包括弓形虫、卡氏肺孢子虫及隐孢子虫动物模型的建立，虫体的分离及提纯；②弓形虫感染的循环抗原（ＣＡ）和抗体（ＩｇＧ、ＩｇＭ），用竞争抑制酶联免疫吸附试验（ＩＥＬＩＳＡ）、金葡菌Ａ蛋白酶联免疫吸附试验（ＳＰＡＥＬＩＳＡ）、直接捕获法酶联免疫吸附试验（ＤＥＬＩＳＡ）进行检测；③用地高辛标记探针及聚合酶链反应（ＰＣＲ）检测核酸，自由引物ＰＣＲ鉴别弓形虫株以及生物特性；④用流式细胞仪对卡氏肺孢子虫及弓形虫的ＤＮＡ、ＲＮＡ及蛋白质含量的动力学进行了分析；⑤用激光微束系统对含８个子孢子成熟包囊施行手术，切除４个或２个子孢子后，包囊仍具有感染力。

卡氏肺孢子虫个体发育与种群动力学的研究

首先建立Wistar大鼠及NCS系裸小鼠(nu/nu)卡氏肺孢子虫(Pneumocy stis carinii,P.c)实验动物感染模型,经梯度离心得到纯净的活体P.c包囊,证明了包囊能发育为滋养体阶段。用激光微束系统对含8个子孢子的包囊施行激光显微外科手术,切除包囊内4个或2个子孢子,再把术后包囊接种裸小鼠,表明术后包囊仍具有感染力,仍能发育为滋养体及含8个子孢子的包囊,认为8个子孢子的包囊为成熟包囊。用激光流式细胞仪对虫体种群的DNA、RNA、蛋白质含量动力学进行了分析。

弓形虫ROP1基因真核表达重组质粒DNA免疫小鼠的研究Ⅰ.pcDNA3-ROP1真核表达重组质粒的构建

目的构建弓形虫ＺＳ２株ｐｃＤＮＡ３－ＲＯＰ１真核表达重组质粒，为进一步表达及ＤＮＡ免疫做准备。方法用ＰＣＲ技术从弓形虫ＺＳ２分离株的基因组ＤＮＡ中扩增编码棒状体蛋白１（ＲＯＰ１）的基因片段，重组入ｐＵＣ１８克隆载体。将ｐＵＣ１８－ＲＯＰ１中的ＲＯＰ１外源基因片段经酶切、连接等反应，亚克隆入ｐｃＤＮＡ３真核表达载体，再经含氨苄ＬＢ培养基筛选，酶切、ＰＣＲ鉴定。结果从ＺＳ２株基因组ＤＮＡ中扩增出特异的ＲＯＰ１基因片段，克隆成功ｐＵＣ１８－ＲＯＰ１；经亚克隆，筛选鉴定获得了ｐｃＤＮＡ－ＲＯＰ１重组质粒。结论构建成功弓形虫ｐＵＣ１８－ＲＯＰ１重组质粒，亚克隆成功ｐｃＤＮＡ－ＲＯＰ１重组质粒。

弓形虫复合抗原基因SAG1/ROP1在大肠杆菌中表达的初步研究

目的 构建含弓形虫主要表面抗原基因SAG1和棒状体蛋白ROP1复合基因重组质粒 ,并在大肠杆菌中表达 ,检测复合基因表达产物的免疫活性。方法 用亚克隆技术分别把SAG1与ROP1基因克隆至 pET2 8aRT7启动子下游 ,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞 ,经IPTG诱导表达 ,SDS -PAGE及Western -Blot分析。结果 获得pET2 8-SAG1/ROP1重组表达载体 ;SDS -PAGE及Western -Blot印迹显示SAG1/ROP1复合基因表达蛋白产物分子量约为 6 6kD ,具有一定的免疫活性。结论 弓形虫复合抗原基因SAG1/ROP1可在大肠杆菌中表达 ,表达产物具有免疫活性。

弓形虫非同源性不同地理株的GRA1基因体外扩增片段的鉴定及比较研究

目的对弓形虫人源性RH株、人源性ZS_2株、猪源性CN株3个不同地理株的GRA1基因片段鉴定并比较异同。方法采用PCR技术和限制性内切酶技术，分别对弓形虫3株的GRA1基因片段进行体外扩增。扩增的目的基因片段分别用3种内切酶HindⅢ、HPaⅡ、TaqⅠ进行单酶切鉴定、比较。结果从弓形虫3个分离株RH株、ZS_2株、CN标基因组DNA中扩增出785bp的GRA1基因片段。3个株的GRA1基因分别用3种内切酶酶切后，酶切片段与理论值相符。结论实验所用不同来源弓形虫分离株的GRA1基因扩增片段基本相同，且3种限制性内切酶酶切图诺基本一致，表明这3个分离株的GRA1基因高度保守。

含弓形虫ROP1基因真核表达重组质粒DNA免疫小鼠的研究Ⅲ.免疫鼠肌组织表达产物免疫酶法定位及血清IgG抗体测定

目的 用所构建的弓形虫ｐｃＤＮＡ３－ＲＯＰ１ 真核表达重组质粒，经肌肉注射免疫小鼠，观察它在肌组织中的表达及不同免疫途径所诱导的体液免疫应答。方法 碱裂解法大量制备ｐｃＤＮＡ３－ＲＯＰ１ 质粒，免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，每只鼠注射１００ｕｇ，两周后同量加强免疫一次，以ｐｃＤＮＡ３ 空质粒及生理盐水组为对照。于免疫后第５０ 天用间接免疫酶法检测注射局部肌组织重组蛋白的表达；ＥＬＩＳＡ法测定ＩｇＧ抗体滴度。结果 免疫鼠肌组织石蜡切片呈特异性阳性反应；血清ＩｇＧ抗体９０天后测定为阳性；皮下及肌肉不同免疫途径血清均显示阳性结果，无显著性差异。结论 ｐｃＤＮＡ３－ＲＯＰ１质粒ＤＮＡ 免疫小鼠后，肌组织内有重组蛋白表达。

弓形虫P30基因DNA免疫小鼠诱导小鼠体液免疫应答及保护性研究

目的 用重组质粒ｐｃ Ｄ Ｎ Ａ３ － Ｐ３０ 免疫 Ｂ Ａ Ｌ Ｂｃ 小鼠， 观察其 Ｄ Ｎ Ａ 免疫所诱导的小鼠体液免疫反应和保护性作用。方法 大量制备质粒 Ｄ Ｎ Ａ， 肌肉注射免疫小鼠。 Ｅ Ｌ Ｉ Ｓ Ａ 测定 Ｉｇ Ｇ 抗体滴度； 免疫鼠血液组织 Ｐ３０ 基因 Ｐ Ｃ Ｒ 扩增； 弓形虫攻击感染。结果 用 Ｅ Ｌ Ｉ Ａ Ｓ 法检测的抗体 Ｉｇ Ｇ 滴度１∶２５６０ ， 免疫后３ 周及６ 个月从免疫鼠血液组织中检测到 Ｐ３０ 基因；攻击感染实验组的存活时间较对照时间延长（ Ｐ＜ ００５） ， 结论 重组质粒ｐｃ Ｄ Ｎ Ａ３ － Ｐ３０ 免 Ｂ Ａ Ｌ Ｂｃ 小鼠可诱导一定的体液免疫应答， 对抗攻击感染具有一定的保护性。

含弓形虫ROP1基因真核表达重组质粒DNA免疫小鼠的研究 IV.免疫鼠血清细胞因子IFN-γ、IL-2及NO的测定

目的 用 pc- ROP1重组质粒免疫小鼠 ,观察其对细胞因子 IFN-γ、IL - 2及 NO的影响。方法 碱裂解法大量制备 pc- ROP1质粒 DNA,经肌肉注射免疫 BAL B/ c小鼠 ,每只鼠注射 10 0μg,两周后同量加强免疫一次 ,以 pc DNA 3空质粒及生理盐水组为对照。分别于免疫后第 30天、5 0天、70天共三次用双夹心 EL ISA测定血清细胞因子 IFN-γ、IL - 2含量 ;酶法测定NO活性。结果 三次检测免疫组 IFN-γ、IL - 2及 NO含量均显著高于对照组 ,随着免疫时间的延长有增高趋势。结论 pc-ROP1重组质粒 DNA免疫小鼠 ,可刺激细胞因子 IFN-γ、IL - 2产生 。

恶性疟原虫FCC1/HN株CSP抗原基因表达产物在小鼠体内的免疫应答研究

目的： 利用ｐｃＤＮＡ３ 质粒作为载体， 在人宫颈癌细胞（ＨｅＬａ 细胞） 中高效表达恶性疟原虫环子孢子蛋白 （ＣＳＰ）， 观察表达产物诱导ＢＡＬＢ／ｃ小鼠免疫的应答水平。方法： 目的基因ＰｆＣＳＰ在ＨｅＬａ 细胞中表达， 将纯化的表达产物免疫接种小鼠， 通过ＥＬＩＳＡ、Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ 分析、Ｔ 淋巴细胞增殖实验、ＮＫ 细胞活性检测和Ｔ淋巴细胞亚群测定， 观察其诱导ＢＡＬＢ／ｃ小鼠产生体液免疫和细胞免疫的应答水平。结果： ＥＬＩＳＡ 检测抗体滴度达１∶６ ４００；Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔｔｉｎｇ 结果在３８．３ ｋＤａ 相应位置出现较清晰的显色条带；表达产物能特异刺激小鼠脾淋巴细胞增殖、ＣＤ４＋ 与ＣＤ８＋ 细胞有所增加， 并能提高小鼠ＮＫ细胞活性。结论： 真核表达系统ｐｃＤＮＡ３－Ｐｆ／ＨｅＬａ表达产物能特异刺激小鼠产生体液免疫和细胞免疫的应答，

疟疾诊断方法的研究进展

疟疾是一种严重危害人类健康的蚊媒传染病.迄今为止,显微镜镜检(厚血膜,薄血膜)仍是疟疾诊断的金标准.但是显微镜镜检做为一种诊断方法又存在一些问题.由于疟原虫形体小,形态相似,难以染色和检出,要有经验的人员才能做到正确的诊断;同时,镜检费时费力,不适合大规模样品的检测[1]. 七十年代初,随着免疫学技术的发展,间接荧光抗体[1,2]和ELISA[3]均很快在疟疾诊断中得到应用.然而,这些方法也有自身的缺点:首先难以区分是现在还是以前的疟疾感染;其次,疟疾流行区人群的循环抗体水平高,用血清学检测流行区个体的抗体指标意义不大.再有生产特异纯净的抗原成本较高,而且天然抗原的制备技术落后还会直接降低其特异性和敏感性. 近年来,随着分子生物学技术和生物化学技术的提高,以分子(疟原虫结构成份及代谢产物)或DNA为基础的疟疾诊断方法不断涌现.现将疟疾诊断技术方面的进展做一简要的综述.

聚合酶链反应技术检测弓形虫核酸的研究

本文通过克隆的ＲＨ株弓形虫核酸ＴＧＲ４片段，设计并合成了一对长度为２０ｂｐ的寡核苷酸引物，扩增靶序列长度为７７８ｂｐ，建立了聚合酶链反应技术检测弓形虫核酸的特异敏感方法。检测７株弓形虫株及临床疑似弓形虫病患者样本，均出现特异扩增带，而其它８种病原体以及正常人及动物的ＤＮＡ均未见特异扩增带。扩增产物用地高辛素标记作探针，与以上出现特异扩增带的ＤＮＡ模板能斑点杂交，而与无扩增带的其余模板ＤＮＡ无斑点杂交。结果显示，该引物具有高度的保守性及特异性。在含１０５个人白细胞中，可检测到２个弓形虫ＤＮＡ或１ｐｇＤＮＡ。并通过人工感染弓形虫鼠血样品的检测表明，所建立的聚合酶链反应体系具有高度的敏感性，能早期检出弓形虫感染样品，在弓形虫病的临床诊断中具有重要的应用价值。

隐孢子虫卵囊分离纯化方法的比较研究

本文对分离纯化隐孢子虫卵囊的四种方法进行了比较研究，结果显示硫酸锌漂浮—耐酸滤过漏斗法具有操作简便、经济、纯化效果好等优点。适合国内普通实验室使用。

含弓形虫ROP1基因真核表达重组质粒DNA免疫小鼠的研究Ⅴ.IFN-γ基因真核表达重组质粒的构建及其在DNA免疫中基因佐剂的作用

目的 构建ＩＦＮ－γ基因真核表达重组质粒作为基因佐剂，观察其与ｐｃＤＮＡ３－ＲＯＰ１（ｐｃ－ＲＯＰ１） ＤＮＡ共同免疫小鼠所诱导的免疫应答。方法 将ＩＦＮ－γ基因片段定向插入真核表达载体ｐｃＤＮＡ３，双酶切鉴定，获得ｐｃＩＦＮ 重组子；碱裂解法大量制备，经肌肉注射免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，每只鼠注射ｐｃＩＦＮ、ｐｃ－ＲＯＰ１ 各１００μｇ，两周后同量加强免疫一次，以ｐｃＤＮＡ３空质粒及生理盐水组为对照。分别于免疫后第３０ 天、５０ 天、７０天共三次用ＭＴＴ法测定小鼠脾脏Ｔ淋巴细胞增殖活性及ＮＫ细胞活性；双夹心ＥＬＩＳＡ 测定血清细胞因子ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２及酶法测定ＮＯ含量；ＥＬＩＳＡ法测定ＩｇＧ抗体滴度。结果 构建成功的作用下，该两项指标均明显提高，且ＩＦＮ－γ、ＩＬ－２ 及ＮＯ水平均较不加佐剂组显著提高（Ｐ＜ ０．０１）；而对ＩｇＧ抗体滴度无显著影响（Ｐ＞ ０．０５。结论 ＩＦＮ－γ基因佐剂具有协同ｐｃ－ＲＯＰ１ＤＮＡ免疫的作用，可增强免疫鼠细胞免疫应答，ＩＦＮ－γ。

聚合酶链反应技术在隐孢子虫检测中的应用研究

根据Laxer等克隆的微小隐孢子虫（C．parvum）核酸序列片断（pHCl）设计并合成一对长度为20hp的寡核苷酸引物。应用聚合酶链反应，对隐孢子虫核酸进行扩增，结果扩增出452hP的特异性条带，阴性对照无扩增。结果表明所合成引物有高度特异性。用PCR检测隐抱子虫感染动物模型，36份镜检卵囊阳性小鼠粪便均为阳性，18份镜检阴性小鼠粪便17份阴性，一份阳性。

恶性疟原虫疫苗研究Ⅳ──恶性疟原虫保护性抗原复合基因(PfCMR)的克隆与高效表达

将恶性疟原虫保护性抗原复合基因（PfCMR）与表达质粒pWR450—1分别经BamHI、EcoRI双酶切后回收、纯化和重组并转化大肠杆菌JM109，再经含氨苄青霉素LB培基初筛后，挑白色菌落扩增，用PCR复筛和双酶切鉴定，阳性克隆子pWR450—1—B14用IPTG诱导，在JM109中表达。表达产物经SDS—PAGE分析，在65kDa处出现较宽的蛋白条带。用SOS显色法证实此表达蛋白具有β-半乳糖苷酶活性。表达的融合蛋白与抗恶性疟原虫多克隆免疫血清特异结合．其滴度高达1：3200；Westernblot分析显示，表达蛋白能与特异性抗体产生较强的免疫反应。上述结果提示表达的融合蛋白具有生物学和免疫学活性。

恙螨体内恙虫病立克次体经精胞传递的实验研究

本文报道地里纤恙螨雄虫人工接种恙虫病立克次体后与雌虫配对培养和传代，应用幼虫叮咬小鼠分离立克次体和PCR结合核酸杂交（核酸杂交检测PCR产物）检测子代体内立克次体的结果。幼虫叮咬小鼠分离立克农作检查第3子代幼虫体内立克次体阳性。PCR结合核酸杂交检测佛山市的病人恙虫病立克次休（未定株）接种雄虫和健康雌虫配对的第1、2、3子代成虫体内立克次体DNA阳性。Karp株接种雄虫的第1子代幼虫体内立克次体的幼虫叮咬小鼠法和PCR结合核酸杂交均呈阳性。

小睾并殖吸虫的宿主调查研究

本文对小睾并殖吸虫的自然宿主和实验宿主作了初步的调查与实验研究。结果证实其第一中间宿主为拟钉螺属的几种拟钉螺;第二中间宿主是景洪溪蟹和毛足溪蟹;适宜的终宿主为犬与猫。果子狸与大鼠能获得感染,但似为不适宜宿主。一只恒河猴未感染成功。

广东哺乳类及两栖类寄生吸虫四新种的记述(吸虫纲:蹲茎科、蛙蠕科)

作者在广东省梅县市发现四个吸虫新种:1.鼠丽色吸虫,新种Reesella ratta sp. nov., 2.后囊蛙蠕吸虫,新种Batrachotrema optstosacca sp. nov., 3.梅县后平睾吸虫,新种Opisthioparorchis meixianensis sp. nov., 4.大卵后平睾吸虫,新种Opisthioparorchis megaloonos sp. nov.,它们分别归隶于蹲茎科Cathaemasiidae及蛙蠕科Bstrachotrematidae。模式标本保存于中山医科大学寄生虫学研究所。

疟原虫裂殖子顶端膜抗原研究进展

疟原虫裂殖子顶端膜抗原１（Ａｐｉｃａｌｍｅｍｂｒａｎｅａｎｔｉｇｅｎ１，ＡＭＡ－１）存在于疟原虫裂殖子顶端复合体中，在裂殖体成熟破裂时，被迅速散布到裂殖子整个表面［１～３］。一旦裂殖子钻入红细胞形成环状体后，ＡＭＡ－１即不复检出，推测其与裂殖子入侵红...

恶性疟原虫传播阻断抗原的化学拼接与克隆

采用缺口填补法将恶性疟原虫有性期Pfs230和Pfs48／45抗原中的2个T细胞表位，3个B细胞表位以及人白介素-Ⅰ中的一个T细胞激活位点按预设方案，拼接成复合多价基因PfSI。复合基因全长147bP，编码43肽复合抗原，经分离、纯化后，插入质粒pcDNA3的多克隆位点，构建重组载体pcDNA3／PfSI。再将重组载体转化大肠杆菌JM109，用氨苄青霉素和PCR扩增法筛选阳性克隆，最后用限制性内切酶对阳性克隆进行鉴定。复合基因PfSI拼接、克隆的成功为在体外高效表达恶性疟原虫传播阻断抗原创造了条件。