人羊膜诱导胚胎干细胞向表皮样干细胞的定向分化

【目的】探索体外定向诱导胚胎干细胞 (ES细胞 )分化为表皮样干细胞的条件 ,为研究其分化机理及寻找新的皮肤组织工程种子细胞奠定基础。【方法】将小鼠胚胎干细胞单独 (对照组 )或与人羊膜共培养 4～ 5d ,观察其形态分化 ,分别用β1整合素免疫组化和流式细胞仪检测胚胎干细胞向表皮样干细胞的分化。【结果】与人羊膜共培养 4～ 5d后 ,ES细胞分化为表皮细胞样的单层细胞 ,细胞排列紧密 ,呈多边形 ,免疫组织化学染色后 ,多数细胞呈现 β1整合素阳性 ,对照组大量细胞死亡 ,未见 β1整合素阳性细胞 ;流式细胞仪检测结果显示 :实验组和对照组β1整合素阳性细胞分别为 81 4%和 8 4% ,两者比较差异显著 ,Z检验P <0 0 1。

胚胎干细胞向表皮样干细胞分化体外条件的研究

目的 探索体外诱导胚胎干细胞分化为表皮样干细胞的最佳条件 ,为研究其分化的调控机理及寻找新的皮肤组织工程种子细胞奠定基础。方法 将小鼠胚胎干细胞与人羊膜共培养 ,以不同的羊膜铺布方式 ,分 4个实验组 :(1)羊膜上皮面向上铺布全孔底 ,(2 )羊膜基底面向上铺放全孔底 ,(3)羊膜上皮面向上铺布半孔底 ,(4)羊膜基底面向上铺布半孔底 ,以未加羊膜为对照组 ,倒置显微镜下观察细胞的生长和形态分化 ,用抗 β1整合素单克隆抗体免疫组化检测胚胎干细胞向表皮样干细胞的分化。结果 培养 4～ 5d后 ,实验组 (3)中的ES细胞分化为表皮样干细胞 ,细胞呈多边形 ,体积增大 ,排列紧密 ,形成大面积细胞单层 ,而其他各实验组 ,ES细胞虽可分化为表皮样细胞 ,但呈集落生长 ,不形成细胞单层 ;对照组大量细胞死亡 ,形态各异。各实验组的细胞绝大多数呈现 β1整合素阳性 ,而对照组未见 β1整合素阳性细胞。结论 与羊膜共培养可诱导胚胎干细胞分化为表皮样干细胞 。

脑损伤组织提取液对成年大鼠损伤的大脑皮质神经元的作用

本研究的目的是探讨神经元的再生。ＳＤ成年雄性大白鼠３８只，随机配对为实验组和对照组。大鼠经切除双侧大脑皮质顶叶下正中部分（４ｍｍ×３ｍｍ×１ｍｍ），用大约２ｍｍ×２ｍｍ×１ｍｍ海绵胶（ｇｅｌｆｏａｍ）粒浸入脑损伤组织提取液（ＢＷＴＥ）中，术时将上述海绵胶粒放入大脑皮质损伤腔内，２个月内加入ＢＷＴＥ４次。对照组用上述方法加入等量的Ｈｎｎｋ’ｓ液，术后６０ｄ取材。取含损伤腔的大脑皮质，用Ｎｉｓｓｌ染色，辅以神经丝抗体免疫染色以及电镜结合体现学定量方法分析，结果实验组与对照组相比发现ＢＷＴＥ组可明显促进损伤皮质神经无的存活（Ｐ＜０．００１）。实验组出现较多胞体增大的神经元（Ｐ＜０．０２），且多具有粗大的顶树突。体视学定量方法分析结果是：神经元的线粒体体密度、数密度、面密度以及粗面内质网的面密度均较对照组增加（Ｐ＜０．０５）。提示ＢＷＴＥ对成年大鼠损伤的皮质神经元具有神经营养活性，可能含有神经营养因子（ｎｅｕｒｏｎｏｔｒｏｐｈｉｃｆａｃｔｏｒｓ，ＮＴＦｓ）。

人Bowes黑色素瘤细胞的培养液中组织型纤溶酶原激活剂的提纯

用大量培养人Ｂｏｗｅｓ黑色素瘤细胞的技术，在短期内获得了大量含组织型纤溶酶原激活剂ｔ－ＰＡ）的培养上清液。经ＳＰ－ＳｅｐｈａｄｅｘＣ５０柱分离及ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－１００柱凝胶过滤纯化。从１Ｌ培养上清液中可收获ｔ－ＰＡ０．１６ｍｇ。

LSCM观察三七总皂甙及其组分对游离钙离子影像变化的影响

用盖玻片或ＭａｔＴｅｋ培养皿培养猪主动脉内皮细胞（ａＥＣ）约１８ｈ后，以荧光探针（ｆｌｕｏ－３／ＡＭ终浓度１０μｍｏｌ·Ｌ－１）负载，当细胞内游离钙离子（Ｃａ２＋）与ｆｌｕｏ－３结合后，通过激光扫描共聚焦显微镜（ＩｎＳＩＧＨＴ－ｐｌｕｓＩＱ型）观察细胞的荧光影像变化。基于三七总皂甙（ｔ－ＰＮＳ）对ａＥＣ所产生的生物活性物质有明显的作用，本拟进一步探索上述药物对ａＥＣ中［Ｃａ２＋］；的影响。实验结果显示：在ＡＴＰ作用后，ｔ－ＰＮＳ可使ａＥＣ内的荧光强度在２０～８０ｓ内急剧升高至峰值。但其组分Ｒｂ１及Ｒｇ１使荧光强度有下降或无明显变化。提示ｔ－ＰＮＳ有使内皮细胞［Ｃａ２＋］；升高的作用。

神经前体细胞的分离培养及绿色荧光蛋白基因的转染

【目的】为替换中枢神经损伤后死亡的神经元提供方便追踪观察的神经前体细胞。【方法】应用含碱性成纤维生长因子 (bFGF)的无血清培养技术 ,从新生大鼠海马组织分离培养神经前体细胞 ,并借助免疫组织化学技术检测这些细胞巢蛋白 (nestin)的表达以及细胞分化后神经丝蛋白 (NF)和胶质原纤维酸性蛋白 (GFAP)的表达。采用磷酸钙法将绿色荧光蛋白(GFP)基因转染目的细胞内。【结果】从海马组织分离的细胞具有分裂能力 ,能表达nestin。分化后一些细胞能表达NF ,而另一些细胞则表达GFAP。GFP基因修饰的细胞能发出荧光。【结论】从海马组织分离的细胞能表达nestin ,属于神经前体细胞 ,它们具有明显的增殖能力。有些神经前体细胞已经分化为神经元和神经胶质细胞。GFP基因已成功转染到神经前体细胞内 ,并表达了GFP。

神经肽PACAP拮抗低密度脂蛋白对内皮细胞的损伤

以体外培养的内在细胞（ＥＣ）为模型，观察神经肽ＰＡＣＡＰ对ＥＣ受低密度脂蛋白（ＬＤＬ）损伤的影响．结果表明：单纯加入ＬＤＬ至培养液时，ＥＣ出现胞体收缩．细胞膜破坏等明显的损伤性改变，在条件培养液中组织型纤溶酶原激活物（ｔ一ｐＡ）的含量显著降低，脂质过氧化物（ＭＤＡ）的产生显著增加（Ｐ０．０１）：而在培养液中同时加有ＰＡＣＡＰ（１０ＥＣ，形态损伤不明显，培养液中ｔ－ＰＡ的含量升高（Ｐ＜０．０１），ＭＤＡ的水平接近正常。此外，如只加入ＰＡＣＡＰ培养ＥＣ，条件培养液中前列环素（ＰＧＩ２）的产生显著高于正常对照组（Ｐ＜０．０１）。以上结果提示神经肽ＰＡＣＡＰ可能拮抗ＬＤＬ对ＥＣ的损伤，并在抗动脉粥样硬化方面发挥作用。

霍乱毒素对金黄地鼠视网膜神经肽Y免疫反应节细胞再生的影响

【目的】研究NPY免疫反应 (IR)视网膜节细胞 (RGCs)能否再生及玻璃体内注射霍乱毒素 (CTx)或 /和玻璃体植入外周神经对其再生的影响。【方法】 16只成年金黄地鼠随机分 4组 ,每组 4只动物。切断视神经 (ON)并缝接坐骨神经 (at tachedgraft,AG)为再生对照组即AG组 ;ON切断并缝接坐骨神经后再于玻璃体内注射CTx或 /和植入小段坐骨神经 (SN)为实验组。荧光金逆行标记再生的RGCs结合NPY免疫荧光组化双标法 ,观察视网膜平铺片并记数。【结果】术后 4周 ,AG组每个视网膜NPY IR阳性再生RGCs平均数为 5 8± 2 2个 ,占再生RGCs总数的 3 36 % ;AG +CTx、AG +SN和AG +CTx +SN各实验组该类再生节细胞平均数依次为 (143± 47)、(12 5± 37)和 (4 37± 37)个 ,它们分别占再生RGCs总数的 (5 15±0 89) % ,(5 34± 0 37) %和 (8 11± 0 85 ) % ,与对照组的差异具统计学意义。【结论】成年哺乳动物NPY IR阳性RGCs能再生 ,玻璃体内注射CTx或 /和植入SN ,可能促进该类RGCs再生。

全反式维甲酸对大鼠骨髓间质细胞的诱导分化作用

【目的】探讨全反式维甲酸对大鼠骨髓间质细胞 (BMSCs)的诱导分化作用。【方法】从大鼠骨髓中分离培养间质细胞并传至第 6代 ,诱导前 2 4h加 1μg·L-1碱性成纤维生长因子 (bFGF)入培养液中以促分裂 ,再以反式维甲酸作诱导剂 ,然后观察细胞形态的变化 ,并采用免疫组织化学法 ,对诱导后第 4天的细胞行巢蛋白 (nestin)、神经丝蛋白 (NF)、神经元特异性烯醇化酶 (NSE)表达的检测。对第 8天的细胞行脂肪细胞特异性苏丹Ⅱ染色。【结果】诱导后第 4天的部分细胞不仅在形态上表现为神经元样 ,而且呈nestin、NF及NSE阳性 ;诱导后第 8天的部分细胞呈苏丹Ⅱ染色阳性。【结论】骨髓间质细胞具有多向分化潜能 ,在反式维甲酸作用下 ,可被诱导成神经元样细胞及脂肪细胞。

移植视网膜NOS阳性神经元的发育

目的 观察不同年龄组段大鼠正常视网膜及移植视网膜内NOS阳性神经元的发育情况及其定位分布。方法实验分正常视网膜发育组和移植视网膜发育组 ,应用还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸 (NADPH)组织化学方法显示。结果 1、NOS阳性神经元最早出现于生后第五天 (P5 ) ,P18时阳性神经元数目达到最高峰。 2、移植视网膜具有正常视网膜的各层结构和相似的生长规律 ,NOS阳性神经元在生后第 4天移植视网膜 (TP4)中出现 ,TP12数量达到高峰值 ,TP2 2后降至正常成年鼠水平。结论 根据NOS阳性神经元的定位、分布 ,推测其为无长突细胞、移位无长突细胞及节细胞。

三七总皂甙对成年地鼠视网膜节细胞存活的影响

目的：探讨三七总皂甙对提高切断视神经后节细胞存活的作用。方法：用荧光素逆行示踪标记法和定量解剖学技术观察正常和经三七总皂甙处理的动物于切断视神经５、７、１４ｄ后视网膜节细胞的密度。结果：①正常视网膜节细胞平均密度为（２００７±１１５）／ｍｍ２；②切断视神经５、７、１４ｄ后其视网膜节细胞平均密度分别下降至：（１１９８±１０７）／ｍｍ２，（８２５±４０）／ｍｍ２和（１９６±１０）／ｍｍ２；③给予生理盐水的对照组在上述各时间组视网膜节细胞平均密度与单纯切断视神经组结果相似；④给予三七总皂甙的实验组在５、７、１４ｄ视网膜节细胞的平均密度分别为（１４６１±９６）／ｍｍ２；（１０６４±９１）／ｍｍ２）和（３０２±１９）／ｍｍ２，与切断视神经组和生理盐水对照组相比在各时间组上均存在显著性差异（Ｐ＜０．０５）。结论：三七总皂甙可提高切断视神经后成年金黄地鼠视网膜节细胞的存活，三七总皂甙的抑制钙内流作用可能与提高切断视神经后视网膜节细胞的存活有关。

霍乱毒素对成年金黄地鼠视网膜节细胞存活的影响

近端切断成年金黄地鼠视神经，视网膜节细胞大量死亡，两周后达９０％。本研究应用荧光逆行示踪标记技术，观察玻璃体内注射霍乱毒素对视神经切断后视网膜节细胞存活的影响。结果表明：①正常视网膜节细胞平均密度为２００７±１１５／ｍｍ２；②切断视神经５、７、１４ｄ后，视网膜节细胞平均密度分别下降至：１１４７±２０９／ｍｍ２、８７３±１２３／ｍｍ２和２０１±７３／ｍｍ２；③给予Ｎａ２ＥＤＴＡ／ＮａＣＬ的对照组在上述各时间组视网膜节细胞平均密度与单纯视神经切断组结果相似；④给予霍乱毒素的实验组在５、７、１４ｄ视网膜节细胞的平均密度分别为１４３６±１５０／ｍｍ２、１１９２±１２９／ｍｍ２和４１３±９０／ｍｍ２，与视神经切断组和Ｎａ２ＥＤＴＡ／ＮａＣＬ对照组相比在各时间组上均存在显著性差异（Ｐ＜０．０５）。

P物质样免疫反应性神经元在蟾蜍视网膜的定位与分布

用免疫组织化学ＡＢＣ方法，研究Ｐ物质（ＳＰ）样免疫反应性神经元在蟾蜍视网膜的定位与分布。结果表明：在５８０个免疫反应阳性细胞中。４３％为Ⅰ型无长突细胞，４１％为Ⅱ型无长突细胞，１６％的细胞体位于节细胞层，暂定为移位无长突细胞。ＳＰ样免疫反应突起分布于内网层的第１、３、５亚层，以第３亚层最丛密，形成一致密的网层，第５亚层次之，第１亚层最稀少，不形成连续的网层。在视网膜平铺片上，ＳＰ样免疫反应细胞体均匀分布于视网膜中央区和周围区，其密度为５３６±１０７个／ｍｍ２（平均数±标准差）。它们的树突野呈对称和非对称两型，前者的树突野大小为５００～７００ｍ×２００～５００ｍ，后者的长突约为３００～５００ｍ。

雪旺细胞移植对中枢神经再生的影响

雪旺细胞是一种有多项生理功能的神经胶质细胞。本文在作用机制、培养方法及其对神经元轴突再生和功能修复方面 ,简述了它对中枢神经再生的促进作用及其研究进展 ,为进一步应用雪旺细胞治疗中枢神经损伤提供资料。

垂体腺苷酸环化酶激活肽对血管壁细胞成分的作用及其机制的实验研究——PACAP与动脉粥样硬化关系的探讨

以培养的猪主动脉内皮细胞（ＥＣ）和肺动脉平滑肌细胞（ＳＭＣ）为主要实验对象，研究了垂体腺苷酸环化酶激活肽（ＰＡＣＡＰ）对正常及高脂环境下培养的ＥＣ、ＳＭＣ形态和功能的影响，并对其作用机制进行了初步探讨。结果显示：ＰＡＣＡＰ可部分对抗高脂因素造成的ＥＣ、ＳＭＣ形态的损伤；能提高ＥＣ抗动脉粥样硬化（ＡＳ）物质的产生；抑制ＳＭＣ的增殖；并具有抗脂质过氧化作用。本研究表明，ＰＡＣＡＰ对ＥＣ、ＳＭＣ具有一定程度的细胞保护作用，因此提示ＰＡＣＡＰ可能具有一定的抗ＡＳ作用。

IBMX对成年金黄地鼠视网膜节细胞存活的影响

【目的】探讨玻璃体内注射 3 异丁基 1 甲基黄嘌呤 (IBMX)对切断视神经后视网膜节细胞存活的影响。【方法】用荧光素逆行示踪标记法和定量解剖学技术观察各组成年金黄地鼠于视神经切断 5、7、14d后视网膜节细胞的密度。【结果】①正常视网膜节细胞平均密度为 (2 0 0 7± 115 ) /mm2 ;②视神经切断 5、7、14d后 ,视网膜节细胞平均密度分别下降至 :(10 10± 131) /mm2 ,(782± 5 5 ) /mm2 和 (2 14± 30 ) /mm2 ;③给予DMSO/生理盐水的对照组在上述各时间段视网膜节细胞平均密度与单纯视神经切断组结果相似 ;④给予IBMX的实验组在 5、7、14d视网膜节细胞的平均密度分别为 (140 2± 6 9) /mm2 、(1182± 194) /mm2 和 (483± 17) /mm2 ,与视神经切断组和DMSO/生理盐水对照组相比在各时间段上均存在显著性差异 (P<0 0 5 )。【结论】IBMX可提高视神经切断后成年金黄地鼠视网膜节细胞的存活 ,IBMX可能通过提高胞内的cAMP水平而促进视神经切断后视网膜节细胞的存活。

垂体腺苷酸环化酶激活肽对内皮细胞表面低密度脂蛋白受体分布的影响

为研究垂体腺苷酸环化酶激活肽对内皮细胞表面低密度脂蛋白受体分布的影响，以胶体金─低密度脂蛋白为示踪物，结合透射电镜技术观察垂体腺苷酸环化酶激活肽作用于体外培养的内皮细胞后，其表面低密度脂蛋白受体分布变化情况。结果表明，垂体腺苷酸环化酶激活肽作用于内皮细胞后，内皮细胞光镜及电镜下的形态与对照组无明显差异，但内皮细胞表面低密度脂蛋白受体分布发生了变化，胶体金─低密度脂蛋白颗粒单独出现率升高（P＜0．05），内皮细胞内吞胶体金─低密度脂蛋白减少。提示垂体腺苷酸环化酶激活肽可能通过影响内皮细胞表面低密度脂蛋白受体的分布状态而减少低密度脂蛋白入胞代谢，进而减少低密度脂蛋白通过内皮细胞进入内膜下的机会，从而在抗动脉粥样硬化方面发挥作用。

CPT-cAMP对成年金黄地鼠视网膜节细胞存活的影响

目的 探讨眼球玻璃体内注射CPT cAMP对切断视神经后视网膜节细胞存活的影响。方法 用荧光素逆行示踪标记法和定量解剖学技术观察视神经切断 5、7和 14d后成年金黄地鼠视网膜节细胞的密度。结果 (1)正常视网膜节细胞平均密度为 2 0 0 7± 115 /mm2 ;(2 )视神经切断 5、7、14d后 ,视网膜节细胞平均密度分别下降至 :10 10± 131/mm2 、782± 5 5 /mm2 和2 14± 30 /mm2 ;(3)给予DMSO/生理盐水的对照组在上述各时间段视网膜节细胞平均密度与单纯神经切断组结果相似 ;(4)给予CPT cAMP的实验组在 5、7、14d视网膜节细胞的平均密度分别为 1398± 2 45 /mm2 、12 93± 84/mm2 和 5 0 1± 72 /mm2 ,与视神经切断组和DMSO/生理盐水对照组相比在各时间段上均存在显著性差异 (P <0 0 5 )。结论 CPT cAMP可提高视神经切断后成年金黄地鼠视网膜节细胞的存活。

视网膜血供与缺血的实验研究现状

视网膜缺血是引起视觉丧失最常见的一种病理生理过程，其病因复杂，发病人数多，临床上尚无有效的治疗手段。本文对其动物实验研究包括视网膜缺血膜型，缺血耐受时间、缺血后视网膜组织病理学改变、缺血后视功能检测及其治疗等方面进行综述．以期对视网腹缺血有一全面的认识，为进一步研究视网膜缺血提供信息。

黄嘌呤抗视神经切断后视网膜细胞凋亡的作用

目的 探讨眼球玻璃体注射 3 异丁基 1 甲基 (IBMX)对切断视神经后视网膜细胞凋亡的作用。方法 用荧光核染料 332 5 8和琼脂糖凝胶电脉技术观察切断视神经 5、7和 1 4d后成年金黄地鼠视网膜细胞凋亡的变化。结果 ( 1 )视神经切断 5、7、1 4d后 ,节细胞层 (GCL)细胞凋亡密度 (cell/mm2 )分别为 94 60± 2 9 40、81 2 0± 1 5 1 9和 31 2 0± 1 1 43,给予IBMX组在上述时间点凋亡密度为 67 80± 1 3 83、60 2 0± 9 68和 2 7 0 0± 9 5 7。IBMX 7d组与对照组比较有显著差异 (P <0 0 5 )。 ( 2 )琼脂糖凝胶电脉显示切断 7d的视网膜细胞DNA抽提物显示典型的DNA梯形条带。其它各间间点 ( 5d和 1 4d)以及玻璃体内注射IBMX均未见典型DNA梯形条带。