肝豆状核变性患者Wilson病蛋白及其基因的改变

目的探讨肝豆状核变性(WD)发病的分子生物学机制.方法通过肝活检获得 WD 患者的肝标本,利用体外胶原酶温育分离并培养肝细胞,对 WD 患者肝细胞 WD 蛋白进行Western-blot 蛋白印迹检测;同时采用荧光 PCR 技术筛查其WD 基因突变,并进行直接 DNA 测序.结果肝细胞蛋白印迹可见特异 WD 蛋白(M_r155 000条带)的表达.3例 WD 患者中 WD1的 M_r155 000条带密度无明显变化,WD2,WD3的特异条带密度降低,仅有对照组的36%,提示其 WD 基因肝内表达异常;荧光 PCR 筛查发现一例患者存在exon8 Arg778Leu 突变,DNA 直接测序证实为2333 G→T杂合突变.结论 WD 基因在 WD 患者肝细胞的表达存在异常,这可能与WD 基因 Arg778Leu 位点突变有关,直接检测 WD 基因产物有助于研究 WD 的病理机制.

WilSon病蛋白及其基因在肝豆状核变性患者中的改变

目的探讨肝豆状核变性(WD)发病的分子生物学机制.方法通过外科手术获得3例WD患者、2例对照者的肝活检标本,利用胶原酶温育消化法分离肝细胞,并进行体外原代培养;肝细胞裂解离心后,使用6%聚丙烯酰胺凝胶行SDS-PAGE电泳,分离WD蛋白;以抗人WD蛋白抗体为第一抗体、辣根过氧化物酶标记的羊抗兔抗体为第二抗体,对肝细胞WD蛋白进行Westem-blot印迹检测,观察特异性条带数目、密度深浅和分子量大小;同时采用荧光PCR技术,筛查所有研究对象WD基因8号外显子(exon8)的突变情况,对异常者进行DNA直接测序结果WD患者及对照者肝细胞WD蛋白Westem-blot检测均表现为特异的155kDa条带,3例WD患者中1例无明显变化,另2例出现155kDa条带密度降低,仅有对照组密度的1/3～1/2,提示这两例患者的WD蛋白在肝内表达异常;荧光PCR筛查发现1例患者存在exon8Arg778Leu突变,DNA直接测序证实为2273G→TG杂合突变.结论WD基因蛋白产物在WD患者肝细胞的表达存在异常,这可能与WD基因Arg778Leu位点突变有关,直接检测WD基因蛋白产物有助于研究WD的发病机制.