丙型肝炎病毒感染及其抗原表达与细胞凋亡的关系

目的：细胞模型上研究表明，ＨＣＶ抗原能抑制细胞凋亡。本研究在体内研究水平进一步探讨ＨＣＶ抗原表达对细胞凋亡的影响。方法：采用原位细胞凋亡、免疫组织化学及其双染色等技术，对７０例肝细胞癌（ＨＣＣ）和１０例慢性肝炎的组织标本进行研究。结果：ＨＣＶ感染或组织ＨＣＶ抗原表达阳性的患者中，细胞凋亡指数与阴性患者无显著性差异。而仅有纤维化的慢性肝炎组织较伴有肝硬变的癌周组织的凋亡指数显著升高（２０２７±２４１ｖｓ８４７±３２４，Ｐ＜００１）。在分布上，慢性肝炎组织中细胞凋亡与抗原分布一致，与炎症反应密切相关，而癌周组织中两者常不一致。结论：在组织水平上ＨＣＶ抗原表达对细胞凋亡的影响相对复杂。感染早期，ＨＣＶ抗原主要通过炎症反应而促进细胞凋亡。

肝细胞癌患者中p53基因的突变研究

为了解肝细胞癌（ＨＣＣ）中ｐ５３基因的突变情况，收集８６例ＨＣＣ手术切除标本，采用聚合酶链反应－单链构象多态性（ＰＣＲ／ＳＳＣＰ）、聚合酶链反应－限制性片段长度多态性（ＰＣＲ／ＲＦＬＰ）和ＤＮＡ序列分析，研究了ｐ５３基因的突变情况。８６例ＨＣＣ中，ｐ５３基因的突变率为３６％，其中，密码子２４９的突变率为３３．７％，１例ＳＳＣＰ和ＲＦＬＰ均提示密码子２４９存在突变者经ＤＮＡ序列分析显示密码子２４９的第三个碱基发生了ＡＧＧ／ＡｒｇＡＧＴ／Ｓｅｒ突变。以上结果提示，ＨＣＣ中，ｐ５３基因的突变主要以点突变为主，主要发生在密码子２４９，其突变率。

三螺旋形成寡核苷酸抑制乙型肝炎病毒复制及抗原合成的实验研究

探讨三螺旋形成寡核苷酸抗乙型肝炎病毒（ＨＢＶ）作用。方法针对ＨＢＶ核心启动子ＳＰＩ位点，台成２１ｍｅｒ硫代磷酸三螺旋形成寡核苷酸（ＴＦＯ２１）及２１ｍｅｒ无关对照寡核苦酸（ＯＤＮｃｏｎ）。采用ＥＬＩＳＡ、斑点杂交法分别检测了经寡核苷酸处理的ＨｅｎＧ２．２１５细胞（简称２．２１５细胞）及空白对照组细胞培养上清ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ及ＨＢＶＤＮＡ水平。结果ＴＦＯ２１组２．２．１５细胞ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ及ＨＢＶＤＮＡ分泌量明显低于空白对照组。ＴＦＯ２１对ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ的抑制分别达５７．５％、７７％。该抑制呈剂量依赖性，并与作用时间有关。而ＯＤＮｃｏｎ对ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ及ＨＢＶＤＮＡ均无影响、其对ＨＢｓＡｇ、ＨＢｅＡｇ的抑制率仅６％～９％，６％～８％。在实验范围内，硫代磷酸寡核酸对２２１５细胞无毒性作用。结论ＴＦＯ２１在体外能有效抑制ＨＢＶ复制及抗原合成，具有较大应用潜力。

反基因及反义寡核苷酸抑制乙型肝炎病毒复制与表达的研究

目的 探讨反基因及反义寡核苷酸抗乙型肝炎病毒(HBV) 作用。方法 设计合成针对HBV 核心启动子Sp1 位点(1734 nt～1754 nt)及前CRNA、前基因组RNA5′端起始区(1814 nt～1834 nt) 的21 聚硫代修饰反基因寡核苷酸(ODNan21)及反义寡核苷酸(ODNas21) 。将各寡核苷酸与22 .1 .5 细胞温育。采用酶联免疫吸附法(ELISA) 及斑点杂交法分别检测经处理的22.1 .5 细胞培养上清HBsAg、HBeAg 及HBV DNA 水平。结果 ODNan21 、ODNas21 处理的22 .1 .5 细胞HBsAg、HBeAg 水平明显低于对照组( P< 0 .001)。浓度为10 μmol/L 时,ODNan21,ODNas21 对HBsAg、HBeAg 的抑制分别达57.% 、77 % ;61% 、79 .6 % ;两者联合给药的抑制达71 .5% 、85 % 。该抑制呈剂量依赖性并于给药后48 小时达高峰。ODNan21 、ODNas21 处理的22 .1.5 细胞HBVDNA 水平低于对照组。无关序列对照寡核苷酸对HBVDNA 及抗原合成无明显影响。在实验范围内,寡核苷酸对22 .1 .5 细胞无毒性作用。结论 ODNan21、ODNas21 在体外能有效抑制HBV 复制及抗原合成。

硫代磷酸寡脱氧核苷酸体外抗乙型肝炎病毒的实验研究

目的了解三螺旋形成寡核苷酸（TFO）、反义寡核苷酸（ODNas）抗乙型肝炎病毒（HBV）作用。方法设计合成针对HBV核心启动子1734nt-1754nt及前C、前基因组RNA5’端起始区的21聚硫代磷酸TFD（TFO21）及21聚硫代磷酸ODNas（ODNas21）。在22．1．5细胞观察了各寡核苷酸的抗HBV作用。结果TFO21、ODNas21处理的22．1．5细胞HBsAg、HBeAg及HBVDNA分泌明显低于对照组。浓度为10μmol／L的TFO21与ODNas21对HBsAg、HBeAg的抑制分别达57．5％、77．0％；61．0％、79．6％。两者联合给药对HBsAg、HBeAg的抑制分别达71．5％、85．0％。该抑制呈剂量依赖性。无关序列对照寡脱氧核苷酸光明显抑制作用。在实验范围内，硫代寡核苷酸对22．1．5细胞无毒性作用。结论在HBV细胞模型系统，TFO21、ODNas21能有效抑制HBV复制及抗原合成，具有较大应用潜力。

HCC癌组织和癌旁组织中HCVRNA检测及半定量分析

ＨＣＶ相关ＨＣＣ癌组织能检出ＨＣＶＲＮＡ负链，但许多学者检测不到或对其检测方法的准确性产生怀疑。作者收集１３例ＨＣＶ相关ＨＣＣ标本，采用严格的负链检测方法和ＰＣＲ半定量方法系统地比较了ＨＣＣ癌组织和癌旁组织中ＨＣＶ总ＲＮＡ和负链的检出情况及其数量关系。ＨＣＣ癌组织和癌旁组织中，ＨＣＶＲＮＡ负链检出率分别为３０．８％（４／１３）和６９．２％（９／１３），平均滴度分别为３．５和２９．２，两者平均相差８．４倍（０－１００倍）。癌组织中ＨＣＶＲＮＡ负链只有癌旁组织中ＨＣＶ总ＲＮＡ的１／９１．６。本研究结果提示，ＨＣＣ癌组织中的确能检出ＨＣＶＲＮＡ负链，但水平较低。这种可能存在的低水平ＨＣＶ复制对ＨＣＣ的影响可能不大。因而，临床观察和流行病学研究所揭示的ＨＣＶ与ＨＣＣ相关的基础可能存在于ＨＣＣ发生过程的早期，即启动或早期克隆扩增阶段。