空斑试验在微生物实验教学中的改进及应用

目的通过更换侵染病毒来改进制作“空斑试验”示教板,以得到更鲜明的“空斑试验”结果,使其更好地服务本科实验教学。方法用不同滴度的寨卡病毒和登革病毒感染培养于12孔细胞培养板的Vero细胞,置37℃吸附2 h。吸附后,用1%甲基纤维素Eagle氏覆盖液进行覆盖步骤,置细胞于37℃培养6~7 d将细胞固定和染色后,用自来水冲洗,待干。结果感染寨卡病毒的未死亡脱落的Vero细胞被结晶紫染色,紫色背景明显。肉眼可看到寨卡病毒感染细胞产生的无色空斑,空斑呈圆形,清晰完整,边缘整齐。空斑数量随着病毒浓度的升高而增加,复孔产生空斑数量趋势一致。感染登革病毒的未脱落Vero细胞被染成紫色,形成较鲜明的紫色背景,登革病毒感染细胞产生了无色空斑,但是空斑的形成数量较少,且不是所有复孔都产生了空斑。随着病毒稀释倍数增加,产生的空斑数量无明显减少趋势。结论用寨卡病毒感染Vero细胞能得到更典型的空斑试验结果,该方法更适用于本科教学制作示教结果用。

广东省2009-2012年呼吸道合胞病毒的流行病学特征

【目的】对急性呼吸道感染症状病人中呼吸道合胞病毒(RSV)流行情况进行监测,分析RSV在广东地区的流行特征,为今后广东地区RSV的监控和防治提供参考资料。【方法】2009年7月至2012年6月期间在广东省25家哨点医院采集急性呼吸道感染病例咽拭子标本,提取标本RNA,反转录成cDNA,利用巢式PCR进行RSV检测;对RSV阳性标本进行其他6种呼吸道病毒的检测,了解混合感染情况。检测结果采用SPSS 13.0统计软件进行分析,用Excel作图表,对病人人口学特征、不同病例类型、不同性别、不同年龄组和时间的检出情况进行统计描述,率的比较用卡方检验,α取0.05。【结果】共收集了14 227份咽拭子标本,7 318份来自门诊病例,6 909份来自住院病例;男性8 485人,女性5 742人;病人年龄从0岁到110岁。RSV阳性标本1 113份,检出率为7.82%。住院病例检出率明显高于门诊病人检出率(P<0.001),男性病例检出率明显高于女性病例(P<0.001),儿童检出率高于成人(P<0.001),阳性病例中2岁以下儿童所占比例为77.72%;1-4月份RSV检出率较高(P<0.001)。245例发生了混合感染,215例为双重感染,29例为三重感染,1例为四重感染。混合感染中男性病例较多,占69.39%(170/245);住院病例比例较大,占74.70%(183/245);小于3岁的儿童和20～35岁青年人较多,分别为75.51%(185/245)、11.43%(28/245)。混合感染多发生在1～4月。【结论】广东地区RSV的主要感染人群是2岁以下儿童,要加强对0～2岁儿童的防护,特别是男性病例和住院病例;预防工作要全年进行,重点在1～4月,预防因RSV感染导致的住院率和混合感染率增高。

DENV2海南分离株NS1全序列测定和生物信息学分析

目的:对登革病毒2型海南分离株NS1全序列进行测定和生物信息学分析,了解其系统进化和分子流行病学特征。方法:采用RT-PCR法扩增D2-Hainan全长NS1基因,将其克隆入载体pPIcZαB,测序,采用相关软件进行生物信息学分析。结果:获得D2-Hainan株NS1全长基因1056bp,其序列与登革病毒2型NGC株的同源性为95%。系统进化树分析显示该毒株与登革病毒2型China04株的亲缘关系最近。初步分析了NS1蛋白的氨基酸序列特征和二级结构。结论:登革病毒流行株存在地域性和复杂性,对D2-Hainan株NS1基因及其编码蛋白信息特征的了解,有助于进一步研究其基因特征与病毒毒力的关系。

广州市登革1型病毒基因组测序及系统进化分析

目的:对引起2002年广州登革热的登革1型病毒分离株(71/02GZ)进行全基因组测序和系统进化分析。方法:采用C6/36细胞培养71/02GZ,分别采用RT-PCR,5’RACE和3’RACE扩增基因组中编码区序列、5’和3’末端非编码区序列,PCR产物克隆到载体并测序,拼接成全基因组序列,分别基于E基因序列、E/NS1连接区240 nt、基因组中10 016 nt进行系统进化分析。结果:71/02GZ株基因组全长10 735 nt,两端非编码区(NCR)长度分别为94 nt和462 nt。基于E基因序列、E/NS1连接区240 nt、基因组中10 016 nt的进化分析结果显示71/02GZ株和2002年广州分离株(GZ01/02,GZ/218/2002),1995年广东分离株(GD23/95,GD01/95)、1995年广州分离株(GZ01/95)组成一个基因型;而1999年广东分离株(GD05/99),1997年广东分离株(GD14/97)和1980年广州分离株(GZ/80)属于另一个基因型;另外,71/02GZ株同1998年印度尼西亚分离株(98901530 DF DV-1-ID)的同源性最高。结论:71/02GZ株可能是印度尼西亚输入的。

广东地区SARS-COV细胞培养模型的建立和初步应用

目的 :建立中国广东地区SARS-CoV细胞培养模型。方法 :通过将SARS -CoV广东地区分离株GD32 2在VeroE6细胞中连续传代 ,检测TCID5 0 ,获得稳定的细胞模型。利用此细胞培养模型 ,对不同温度、紫外线等条件下SARS -CoV的存活时间进行了比较。对重组人复合干扰素α抗病毒效果进行了筛查。结果与结论 :SARS -CoV对外界环境抵抗力比普通冠状病毒强 ,对重组人复合干扰素α有较高的敏感性 ,抑制指数达 4 .9。

两株人H7N9禽流感病毒的全基因组测序及分子特征分析

【目的】对两株从轻症病例和重症死亡病例中分离的人H7N9禽流感病毒进行全基因组测序,研究其来源、基因组特征以及相互间的分子差异,旨在了解毒株的遗传进化特征与其致病性及其所致疾病临床类型的关系,为进一步阐明H7N9禽流感病毒的致病机制提供科学依据。【方法】选取两株从轻症病例和重症死亡病例中分离的H7N9禽流感病毒进行全基因组序列测定;运用生物信息学软件比较分析两株病毒的遗传进化关系、基因组特征、受体结合位点、宿主特异性位点及致病相关位点等重要分子特征;从禽流感共享数据(GISAID)下载2013年至2014年10月轻症和重症病例的病毒分离株序列,分析致病相关关键位点差异,并分析这些变异与其致病性及所致疾病临床类型的关系。【结果】这两株H7N9禽流感病毒的HA、NA和M基因来源于2013年华东地区流行的H7N9禽流感病毒,NP、NS、PA、PB1和PB2基因来源于2013年在广东地区禽类中流行的H9N2禽流感病毒;H7N9禽流感病毒PA蛋白L336M和PB1蛋白I368V的突变率随流行时间的延长而逐渐上升,并存在地区差异;两株病毒各基因核苷酸同源性达到99.2%以上,氨基酸同源性在99.5%以上,但各基因节段存在个别氨基酸的差异,其中HA受体结合位点存在一个关键氨基酸的差异(226L和226 Q),宿主特异性位点存在两个关键氨基酸的差异(PB2-591L和PB2-591Q,PB2-627E和PB2-627K),毒力位点存在两个关键氨基酸差异(PA-353R和PA-353K,PB2-627E和PB2-627K);M2均发生了S31N突变;潜在糖基化位点均相对保守;2013年至2014年10月报道的重症病例病毒分离株PB2蛋白E627K突变率高于轻症病例分离株。【结论】两株来自不同临床类型的H7N9禽流感病毒是一种新的重组病毒,是由华东地区流行的人H7N9禽流感病毒和在广东地区禽类中流行的H9N2禽流感病毒基因重组而来;H7N9禽流感病毒的某些致病相关的关键氨基酸位点在流行的过程中不断发生变异,必须密切监测毒株的变异动向;两株致病力不同的病毒各基因节段虽然同源性较高,但存在关键氨基酸位点的差异,其中PB2蛋白627位氨基酸位点的差异可能对病毒的致病性起重要作用,与所致疾病临床类型相关。

登革病毒流行株的分离鉴定及其毒力位点变异研究

目的：从登革热患者血清中分离登革病毒，鉴定流行株的血清型及其毒力。对其中两分离株E基因进行序列测定，分析其可能的毒力位点变异。方法：采集临床诊断为登革热患者急性期血清91份，接种于C6／36细胞分离病毒，应用间接免疫荧光法鉴定及分型。并通过乳鼠脑内接种和空斑试验，测定分离株的毒力。扩增2株分离株E基因，克隆到pGEM-T载体进行序列测定，分析变异位点。结果：在91份血清中经2-3次传代分离出8株病毒，鉴定为登革1型病毒。在E蛋白影响毒力的3个区段中，两分离株有3处存在变异。结论：推测此次广州地区流行登革热可能由DEN1型病毒感染引起，流行株的毒力较弱。毒力减弱可能和其基因位点变异有关。

SARS冠状病毒的分离培养与鉴定

采集急性期病人的咽拭子或漱口液,用Vero、Vero E6、MDCK、Hela、Hep-2等传代细胞,人胚肺二倍体细胞(HEL)和人胚肺(HP)细胞分离培养严重急性呼吸系统综合症(SARS)的病原体。结果用Vero、Vero E6、MDCK和HP细胞从标本中分离到一株病毒。间接免疫荧光试验发现,恢复期病人血清可与所分离的病毒起反应,在胞膜和胞浆中出现翠绿色荧光;中和试验结果表明,恢复期病人血清能中和病毒对细胞的致细胞病变作用:电镜下可观察到冠状病毒样颗粒:RT-PCR法可扩增到冠状病毒特异性基因片段,且其核苷酸序列与国内外发表的SARS冠状病毒(SARS-Cov)相应的基因序列相符,同源性达到100％。从传染性非典型肺炎病人的漱口液中分离到SARS冠状病毒,这种病毒与传染性非典型肺炎密切相关。

脂多糖诱导血管内皮细胞凝血途径相关因子基因表达变化

目的:观察脂多糖(LPS)对脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)表达组织因子(TF)、组织因子抑制物(TFPI)和凝血酶调节蛋白(TM)的影响。方法:应用胰酶消化HUVECs并进行传代培养,用生长良好的第2、3代细胞进行实验。同时应用CCK-8测定细胞在不同浓度的LPS(1-100 mg/L)处理前后细胞活性;应用反转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测细胞内TM、TF和TFPImRNA水平。结果:浓度为10 mg/L的LPS对细胞活力与对照组相比没有显著差异。浓度为10 mg/L的LPS作用使HUVECs显著上调TF mRNA表达,6-24 h可以使细胞TFPI mR-NA表达下调,以后渐恢复正常表达,72 h达到正常对照组水平,同时下调TM mRNA表达。结论:LPS(10 mg/L)对HUVECs的活性不造成直接的影响,可显著上调HUVECs的TF mRNA转录,抑制TFPI mRNA的转录,而不改变TMmRNA的转录,这可能与LPS在感染过程中诱导血栓形成,血液凝固和D IC发生相关。

宫颈癌中p53表达和病毒感染的研究

应用PCR对121例宫颈脱落细胞和组织分别检测HPV-16/18和HSV-2 DNA。同时应用免疫组化S-P法检测76例宫颈组织中p53过度表达。结果发现,宫颈癌组织中HPV-16/18和HSV-2阳性率分别为61.3％和32.3％,慢性宫颈炎组HPV-16/18和HSV-2阳性率分别为22.5％和20.0％,与正常宫颈组比较均有显著性差异。宫颈癌中HPV-16/18和HSV-2混合感染率为16.1％。p53过度表达率在慢性宫颈炎、宫颈上皮内瘤变(CIN)、宫颈癌组织中呈梯度递增。另外,宫颈癌组织中p53过度表达与HPV-16/18、HSV-2的感染无相关性。提示:宫颈癌的发生与HPV-16/18关系密切,HSV-2可能与HPV-16/18协同作用导致宫颈癌的发生。宫颈组织中p53过度表达率与宫颈癌的进程有关,这在宫颈癌的防治方面有一定的临床意义。

复方小柴胡汤调控microRNA抑制鼻咽癌细胞增殖

目的观察复方小柴胡汤(FFXCHT)对高分化鼻咽癌细胞CNE-1和低分化鼻咽癌细胞CNE-2增殖的抑制作用,探讨其调控CNE-2细胞microRNA的差异表达。方法通过磺基罗丹明B(SRB)法检测FFXCHT对CNE-1和CNE-2细胞增殖的影响;采用μParafloTM MicroRNA芯片检测,激光扫描器收集杂交的图像,经LOWESS滤器规范信号后比较数据,分析FFXCHT处理前后CNE-2细胞microRNA表达的差异。结果 FFXCHT可抑制CNE-1和CNE-2细胞增殖,且呈剂量依赖性;FFXCHT处理CNE-1细胞24h、48h、72h,其IC50分别为12.23mg/mL,4.63mg/mL和4.97mg/mL;其对CNE-2细胞IC50分别为9.67mg/mL,4.33mg/mL,3.09mg/mL。microRNA芯片检测结果显示FFXCHT处理CNE-2细胞后,在检测的326个microRNA中,有10个microRNA上调,1个microRNA下调,其中检测量绝对值在1000以上且两者相差log2(Sample B signal/Sample A signal)>1的microRNA有hsa-miR-513、hsa-miR-498、hsa-miR-210和hsa-miR-602。结论该FFXCHT可抑制高低分化鼻咽癌细胞的增殖,其抑瘤作用可能与microRNA的差异表达有关。

SARS-CoV感染者血清IFN-γ和TNF-α的动态变化及其意义

目的 探讨SARS患者血清IFN γ和TNF α在SARS冠状病毒感染免疫中的作用。方法 应用酶联免疫吸附法 (ELISA)测定广州地区 2 8例SARS冠状病毒感染患者双份血清IFN γ和TNF α的水平。实验数据采用两样本均数t检验法。结果 2 8例SARS冠状病毒感染者急性期血清IFN γ和TNF α水平比正常健康对照组明显增高 (P <0 .0 5 ) ;恢复期血清IFN γ水平比正常健康对照组明显增高 (P <0 .0 5 )。感染病程第 1周 ,患者血清IFN γ水平达高峰 ,然后逐渐下降。SARS患者血清TNF α水平在病程第 2周达高峰 ,然后逐渐下降。结论 IFN γ和TNF

不成熟CD8α^+ DC经同种白血病抗原冲击后移植物抗白血病效应的体外研究

目的:观察不成熟CD8α+树突状细胞(DC)体外经同种异基因白血病细胞全抗原冲击后的移植物抗白血病(GVL)效应。方法:C57BL/6(H-2b)小鼠的骨髓细胞以GM-CSF+IL-4+SCF+Flt3L体外诱导不成熟CD8α+DC,第3 d加入0 mg/L、2.5 mg/L、5 mg/L、10 mg/L和20 mg/L BALB/c(H-2d)小鼠来源的同种异基因EL9611红白血病细胞抗原冲击,冲击后DC与同系(H-2b)T细胞按DC/T 1∶1、2∶1、4∶1比例共培养,MTT法观察T细胞增殖情况,ELISA法检测上清中IFN-γ和IL-10的含量,LDH释放法检测T细胞对EL9611细胞的杀伤活性。以成熟DC为对照,观察同种异基因不成熟CD8α+DC体外对EL9611白血病细胞的GVL效应。结果:同种红白血病全抗原冲击后不成熟CD8α+DC可有效刺激同系T细胞增殖,作用随DC/T比例增加而增加,增殖效应在小剂量抗原(≤5 mg/L)冲击时更明显(P<0.05);Ag冲击后不成熟CD8α+DC刺激T细胞分泌IFN-γ和IL-10明显增高(P<0.05),IL-10的分泌与不成熟CD8α+DC发挥GVL效应存在一定的负相关关系,Ag冲击浓度较低而IL-10分泌少时,T细胞增殖活性较强。杀伤实验结果显示,白血病特异性T细胞对EL9611靶细胞的杀伤活性随抗原冲击浓度的增加而升高,浓度为2.5 mg/L时,杀伤率即可达90%,非特异性杀伤实验显示白血病特异性T细胞对同种异基因正常脾细胞的杀伤活性低于对照组(P<0.05),表明杀伤作用为抗原特异性杀伤,对正常细胞无明显杀伤。结论:经同种异基因白血病抗原冲击后不成熟CD8α+DC体外能刺激同系T细胞产生一定的GVL效应。

应用噬菌体随机肽库筛选2型登革病毒E蛋白的抗原表位

【目的】通过型特异性单抗与噬菌体随机 12肽库的生物淘洗 ,确定 2型登革病毒E蛋白分子的抗原表位。【方法】以DEN2型特异的E单克隆抗体作为筛选分子 ,生物淘洗噬菌体随机 12肽库 ,将筛选的噬菌体阳性克隆进行ELISA检测、DNA序列测定及展示肽的氨基酸序列推导 ,通过展示肽序列与DEN2E蛋白的氨基酸一级结构的对比 ,确定E蛋白的抗原优势表位并用相应的合成肽验证。【结果】常规生物淘洗获得富含芳香族氨基酸并有aHWbW核心结构的克隆 ,确定为非特异的塑料结合噬菌体。改进淘洗方法后 ,肽库筛选的噬菌体阳性克隆有共同的结构模体WFKKGS ,与DEN2E蛋白分子的 390～ 397有 3～ 5个氨基酸相同。其对应的合成 10肽能与淘洗单抗特异反应 ,并可抑制噬菌体阳性克隆与该单抗结合。【结论】本实验通过噬菌体随机肽库的生物淘洗确定DEN2E蛋白 390～ 397氨基酸残基 (WFKKGSSI)存在一线性的B细胞抗原表位。

临床特殊病例的L型细菌分离鉴定

[目的]协助临床查找病原菌,为临床提供诊断参考和用药依据[方法]临床常规细菌分离培养及L型细菌分离培养和真菌培养及药敏试验。[结果]一病例中检出L型金黄色葡萄球菌、细菌型金黄色葡萄球菌及铜绿假单胞菌、白假丝酵母菌。[结论]实验结果显示病人不仅对正常菌群失调引起铜绿假单胞条件致病菌感染产生了多重耐药,而且是进一步菌群失调,白假丝酵母也开始出现。可见临床过度或滥用抗菌素可形成多重感染产生了多重耐药和L型细菌,临床感染的疾病迫切要求微生物检验的质量敏感性准确性的提高和及时报告。而L型细菌的检验比较薄弱,尚有很多具体问题有待进一步深入研究。

SARS冠状病毒S2基因变异性分析

目的测定SARS冠状病毒GD322株S2基因序列并对SARS-CoV S2基因进行系统进化树分析。方法用RT-PCR 法从SARS-CoV GD322株基因组中扩增S2基因片段并克隆至pGEM-T载体,转化大肠杆菌DH5α株后测序。利用 Lasergene、ClustalX、DNAman和Treeview等软件,将基因序列翻译成氨基酸序列后,与早、中、晚期各地暴发的SARS-CoV S2蛋白序列进行比对,构建系统进化树,并在Internet网数据库中对S2蛋白氨基酸序列进行T细胞抗原表位预测。结果随着SARS-CoV的传播流行,S2基因趋于稳定,晚期的SARS-CoV S2基因的同源性达到99．9％。T细胞抗原表位预测发现,SARS-CoV S2蛋白第57位氨基酸突变对T细胞抗原表位有影响。结论 SARS流行过程中SARS-CoV S2 基因较为稳定,S2蛋白57位氨基酸的突变可影响病毒T细胞抗原表位。

基于DENV-prM/E基因构建DENV-VLP及其免疫学特性

[目的]构建和表达登革病毒4型病毒样颗粒,初步研究其免疫学特性.[方法]用RT-PCR法扩增DENV4-prM/E基因,构建重组质粒pGAPZ-sprM/E-D4,转化X33酵母菌株,SDS-PAGE、Western Blot鉴定目的蛋白表达.切片电镜检测病毒样颗粒,蔗糖密度梯度离心纯化.免疫三组Balb/C小鼠,每组15只.采用间接ELISA检测抗原特异性抗体,间接免疫荧光法检测免疫血清与天然病毒粒子的结合,流式细胞术分析小鼠脾淋巴细胞表型,酶联免疫斑点法（ELISPOT）检测脾分泌IFN-γ、TNF-α和IL-10的细胞.[结果]重组质粒在酵母中以病毒样颗粒形式表达,为直径20～ 30hm的球形颗粒,VLP免疫组刺激小鼠产生抗体与灭活病毒组相似,流式及ELISPOT结果提示DENV4-VLP与灭活病毒组相似,用登革病毒抗原刺激后,分泌IFN-γ,TNF-α的细胞数目明显增加,各组分泌IL-10细胞数目的整体水平均不高.[结论]应用毕赤酵母表达系统成功表达获得了DENV4-VLP,具有良好的免疫原性,可诱导Balb/C小鼠产生有效的体液免疫应答,并能诱导Th1型免疫应答而诱导Th2型免疫应答较弱.

PCR条件对扩增SARS-CoV多聚酶部分基因的影响

目的 :对该实验室已建立的检测SARS冠状病毒多聚酶基因的套式RT -PCR方法进行优化。方法 :从SARS病人的嗽口水标本中提取RNA ,调整套式PCR的退火温度 ,扩增SARS冠状病毒多聚酶部分基因。扩增出的阳性片段连接入pGEM -T载体中 ,测序后比较其与已知SARS冠状病毒的同源性。结果 :通过改变PCR条件 ,成功从一SARS病人的嗽口水中扩增出SARS冠状病毒多聚酶部分基因。结论 :针对不同标本优化PCR反应条件非常重要。

运用UP-PCR技术进行食源性感染常见致病菌Hsp60基因的扩增与酶切鉴定

目的 扩增、鉴定食源性感染常见致病菌Hsp60基因。 方法 选取 13种食源性感染常见致病菌 ,采用UP -PCR法扩增其Hsp60基因 ,并对PCR产物进行酶切鉴定分析。 结果 13种食源性感染常见致病菌均可以扩增出约 1.1KB的基因片段 ,蜡样芽孢杆菌PCR产物经HindIII酶切后形成约 684bp和 470bp片段 ,小肠结肠炎耶尔森菌PCR产物经BglII酶切后形成 861bp和 2 96bp片段。 结论 UP -PCR技术能同时扩增出食源性感染常见致病菌Hsp60基因 ,为进一步进行致病菌的种属鉴定和分型研究奠定基础。

海洋抗结核分枝杆菌活性物质研究近况

近年来由于结核杆菌多重耐药菌株及人体免疫缺陷病毒双重感染的出现,使结核病的发病率和死亡率呈上升趋势,开发新的抗结核药物具有重要的社会意义和经济意义。海洋由于其独特的环境,造就了种类繁多、结构新颖多样的生物活性物质,为抗结核病的药物开发提供了广泛的前景。本综述以近年报道的抗结核分枝杆菌活性物质,包括肽类化合物,生物碱类化合物,萜类化合物等为例。简要介绍海洋活性物质的研究近况。