小剂量K562细胞NOD/SCID小鼠动物模型的建立

【目的】探索建立小剂量(1×106)人急性红白血病K562细胞株的NOD/SCID小鼠动物模型及通过流式细胞仪对NOD/SCID小鼠的肿瘤负荷情况进行评价的可行性。【方法】实验组NOD/SCID小鼠分别经尾静脉接种K562细胞1×106、5×106,比较不同剂量接种实验组小鼠的生存时间、组织病理改变及通过流式细胞术对NOD/SCID小鼠体内的肿瘤标记进行检测。【结果】1×106及5×106K562细胞接种的NOD/SCID小鼠的生存时间分别为(30.3±4.3)d和(22.2±3.7)d;其外周血、骨髓及肝、肺组织匀浆中均可发现不同比例的肿瘤细胞;通过流式细胞术检测5×106K562细胞接种组NOD/SCID小鼠外周血、肝匀浆中人CD13表达水平显著高于1×106接种组,而肺匀浆的CD13表达水平两组无显著性差异。【结论】小剂量(1×106)K562细胞NOD/SCID小鼠动物模型的建立是完全可行的,这有助于降低实验成本。

人表皮干细胞体外分选和培养对构建组织工程皮肤种子细胞的可能性

目的:探讨人表皮干细胞在体外分选和培养的可能性,为构建组织工程皮肤寻找理想的种子细胞。方法:实验于2002-01/12在中山大学基础医学院动物中心完成。根据表皮干细胞与Ⅳ型胶原蛋白的高黏附的特性,运用黏附实验将干细胞从培养在鼠Ⅳ型胶原包被的培养瓶的表皮细胞中分选出来,并从形态学、超微结构及免疫组化等方面进行了鉴定。结果:分选出来培养的细胞符合表皮干细胞的特征,说明分选培养的细胞是表皮干细胞。结论:预先在体外对表皮干细胞进行分选和培养是可行的,该细胞群有望成为构建组织工程皮肤的种子细胞,为下一步应用表皮干细胞构建组织工程皮肤奠定了牢固的基础。

抗人CD154单克隆抗体抑制免疫应答的实验研究

目的 :探讨抗人CD1 54单克隆抗体对免疫应答的抑制作用。方法 :①在体外进行混合淋巴细胞反应 ,研究抗人CD1 54单克隆抗体对淋巴细胞增殖反应的影响 ;②在严重免疫联合缺陷 (SCID)鼠体内重建人的免疫功能后 ,研究抗人CD1 54单克隆抗体在SCID小鼠体内对T细胞增殖的影响和对B细胞功能的影响。结果 :①双向混合淋巴细胞反应结果显示 ,抗体的 5个剂量组的 [3H] -TdR的掺入率均显著低于对照组 (均P <0 .0 1 ) ;②在输注人外周血单个核细胞第 6d、第 1 2d、第 2 1d ,实验组SCID鼠体内人T细胞占SCID鼠淋巴细胞的百分率均明显低于对照组(均P <0 .0 5) ;在输注人外周血单个核细胞后的第 1 2d、第 2 1d、第 31d ,实验组SCID鼠体内人IgG的含量明显低于对照组 (均P <0 .0 5)。结论 :抗人CD1 54单克隆抗体能够在体外抑制淋巴细胞的增殖 。

同种异基因脐血移植小鼠模型的建立

探讨胎鼠及新生鼠外周血 (FNPB)移植特性 ,建立同种异基因脐血移植小鼠模型。采用体外集落培养和流式细胞术的方法 ,检测FNPB与骨髓 (BM )造血干 /祖细胞含量与特性。给致死量环磷酰胺预处理的BALB/c(H 2 d)小鼠经尾静脉输注C57BL/ 6(H 2 b)小鼠FNPB ,移植后动态观察受鼠存活状况、植入水平、造血与免疫功能恢复及移植物抗宿主病 (GVHD)发生情况。结果显示 :FNPB中早期红系祖细胞 (BFU E)和CD34+ 细胞含量与BM相近 ,粒单系祖细胞 (CFU GM) (1 4天 ) ,多向祖细胞 (CFU GEMM )及Sca 1 + CD34+ 细胞亚群明显高于BM。FNPB移植能明显提高受鼠存活率 ,重建部分造血与免疫功能 ,未见明显GVHD表现 ,并在受体术后 2 1天骨髓检出供体源造血干细胞占 2 7.94%。结论 :FNPB富含造血干 /祖细胞 。

环磷酰胺预处理脐血移植小鼠模型的建立及其对骨髓龛位的影响

【目的】建立环磷酰胺 (CTX)预处理脐血移植 (UCBT)小鼠模型 ,并探讨预处理后骨髓龛位腾出的特点和机制。【方法】分别以 10 0 ,2 0 0 ,380mg/kg 3种剂量CTX腹腔注射BALB/c小鼠 ,检测注射后 1周内外周血象、骨髓及外周血CD34+细胞含量、骨髓细胞凋亡及病理学改变。用C5 7BL/ 6鼠脐血 (FNPB)作供体移植经“致死量”CTX预处理的BALB/c鼠 ,动态观察移植后受鼠存活状况、植入水平、造血与免疫功能恢复及移植物抗宿主病 (GVHD)情况。【结果】在CTX处理后 3～ 4d内 ,骨髓造血细胞损伤渐加重 ,血窦结构紊乱 ,细胞碎屑弥漫分布 ,外周血与骨髓CD34+ 细胞水平进行性降低至最低值 ,下降的速度和程度与CTX剂量呈正比。骨髓细胞凋亡发生率的峰值出现在第 1天 ,第 3天恢复正常。FNPB移植能明显提高受鼠存活率 ,重建部分造血与免疫功能 ,未见明显GVHD表现 ,并在受体内检出供体细胞的植入。【结论】成功建立CTX化疗预处理小鼠脐血移植模型。干细胞占据的龛位是在化疗预处理后 4d逐渐完成腾空 ,凋亡是参与此过程的机制之一。

小鼠胚胎干细胞植入大鼠脑内存活和增殖

【目的】观察小鼠胚胎干细胞 (ES细胞 )植入大鼠的隔区和海马内后存活和增殖的情况。【方法】以SD大鼠为宿主 ,将BrdU标记的ES细胞植入宿主的隔区和海马内 ,移植后l、2、3、4和 8周后取脑 ,冰冻切片 ,进行尼氏、BrdU、PCNA免疫组织化学染色 ,观察ES细胞存活和增殖的情况。【结果】ES细胞移植入大鼠隔区和海马内后 ,从第l周到第 3周 ,移植物呈团块生长 ,第 4周移植物较第 3周缩小 ,第 8周未发现移植物 ;BrdU和PCNA(核增殖抗原 )免疫染色结果阳性。【结论】小鼠ES细胞移植入大鼠隔区和海马内后 ,可以存活增殖

含P301L突变的Tau转基因小鼠纯合子品系的建立及鉴定

目的:建立含P301L突变的tau转基因小鼠的纯合子品系。方法:雄原核显微注射法获得含P301L突变的tau转基因阳性首建鼠,通过SYBR Green实时荧光定量PCR法和传统育种方式结合鉴定纯合子和杂合子。结果:共选育出95只纯合子,鉴定出的纯合子具有优于杂合子模拟老年痴呆生物学特性改变的优势。结论:外源性基因tau能稳定遗传,采用的SYBR Green实时荧光定量PCR和传统育种方式结合筛选鉴定纯合子和杂合子快速、经济、可靠。

体外定向诱导E14小鼠胚胎干细胞为肝细胞

目的 探索体外定向诱导胚胎干细胞分化为肝细胞。 方法 常规方法培养E14小鼠胚胎干细胞(ESC)后,进行悬滴(?)悬浮培养,形成胚胎体,再进行分阶段定向诱导,在培养第9-12天、第12-18天以及第15-18天分别加入酸性成纤维细胞生长因子、肝细胞生长因子和制瘤素M。利用倒置相差显微镜观察细胞形态变化,逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法分析特异性基因mRNA的表达,并用吲哚氰绿(ICG)摄取和过碘酸雪夫反应(PAS)分析细胞的分化及功能。 结果 在诱导培养的第13天,细胞出现肝细胞样改变。RT-PCR分析可见,在诱导的第6天和第12天分别可以检测到内胚层或卯黄囊分化标志基因--甲状腺素运载蛋白和α1抗胰蛋白酶的mRNA表达,第6天出现未成熟肝细胞标志基因--甲胎蛋白mRNA表达,第9天,第15天和第18天分别开始出现成熟肝细胞的特异性标志基因--白蛋白、葡萄糖6磷酸酶、酪氨酸氨基转移酶mRNA表达。同时,ESC源性肝细胞表现为ICG摄取和PAS反应阳性,经过诱导,ICG阳性细胞数约占85.1％。 结论 ESC源性肝细胞具备肝细胞特性,ESC有可能成为肝细胞治疗的替代供体细胞。

定向诱导小鼠ES细胞为肝脏细胞及其凝血因子Ⅷ,Ⅸ的表达

凝血因子Ⅷ,Ⅸ缺陷导致血友病A和B的发生,肝细胞是产生凝血因子的器官,利用肝细胞进行替代治疗是纠正凝血因子缺陷的根本办法,但是其来源及利用存在难以克服的问题.ES细胞具有体外培养时保持未分化状态和无限的增殖能力,具有在一定条件下可以分化发育成各个胚层细胞的潜能,利用ES细胞源性肝细胞作为供体细胞,解决了肝细胞来源困难、增殖能力差的难题.体外分阶段定向诱导E14小鼠ES细胞分化为肝细胞,ICG摄取及PAS反应结果证实ES源性细胞具备肝细胞功能,在此基础上,利用RT-PCR法对诱导细胞初步进行了凝血因子Ⅷ,Ⅸ表达分析,为进一步开展利用ES细胞纠正凝血因子缺乏奠定了研究基础.

芪归合剂拮抗地塞米松对肾病综合征大鼠生长的抑制作用

目的 观察芪归合剂对地塞米松治疗的肾病综合征大鼠(NS鼠)生长障碍的作用及其可能的机制。方法 制备大鼠阿霉素NS模型,设正常对照组、NS模型组、芪归治疗组、激素治疗组和激素芪归治疗组。测量各组鼠的身长、体重、尿蛋白和血白蛋白水平。以放射免疫法和免疫放射法测各组血、尿胰岛素样生长因子(IGF)-1和IGF结合蛋白(BP)-3水平;用RT-PCR法检测肝IGF-1mRNA、IGFBP-3mRNA表达水平。结果NS模型组体重增长、身长增长、血IGF-1.IGFBP-3低于正常组,尿IGF-1高于正常组(P<0.01或P<0.05);肝IGF-1mRNA表达与正常组无差异,而IGFBP-3 mPNA表达低于正常组(P<0.01)。激素治疗组的体重增长、身长增长、血IGF-1和IGFBP-3水平、肝IGF-1mRNA、IGFBP-3mRNA表达水平低于模型组(P<0.01或P<0.05)。芪归治疗组的身长增长、体重增长、血清IGF-1、IGFBP-3水平、肝IGF-1 mRNA、IGFBP-3 mRNA表达水平高于模型组(P<0.01或P<0.05)。激素芪归组的身长增长、体重增长、血清IGF-1、IGFBP-3水平、肝IGF-1mRNA、IGFBP-3 mRNA表达水平高于激素治疗组(P<0.01或P<0.05)。结论 芪归合剂可能通过增加地塞米松治疗的NS鼠肝IGF-1 mRNA、IGFBP-3 mRNA的表达水平而部分拮抗地塞米松对NS鼠生长的抑制作用。