脂肪间质干细胞在软骨组织工程中的研究现状

脂肪间质干细胞是新发现的一种可以自我更新,具有向软骨、骨、脂肪、肌肉、神经细胞等分化的成体干细胞。目前已经对它进行了深入的研究。在对其生物学特性研究的基础上,进一步研究了它的应用,认为它可以成为组织工程的种子细胞。构建的组织工程组织中比较成熟的是软骨,有望应用于临床。下面就脂肪间质干细胞生物学特性和成软骨的研究进展进行综述。

DANCR在人胚胎干细胞向内胚层分化中的调控功能

【目的】探讨DANCR在人胚胎干细胞(hESC)向内胚层(DE)分化中的作用。【方法】建立体外诱导hESC向DE分化的体系,检测DANCR的表达水平与DE分化的相关性;利用慢病毒体系敲低hESC的DANCR表达水平,将敲低DANCR的hESC进行DE分化;用qPCR和Western blot方法检测DE分子标志物SOX17和FOXA2,以及原条分子标志物Brachyury(T),EOMES,MIXL1和GSC的表达水平;用Dual luciferase reporter assay和qPCR证明在DE分化过程中DANCR与WNT通路的相互作用。【结果】体外诱导hESC向DE分化的体系能够有效模拟体内DE分化,DANCR的表达水平随DE分化进程逐渐下降。建立敲低DANCR的hESC细胞株,DANCR表达水平相比对照组显著降低(P<0.001)。干扰DANCR表达使分化早期的原条分子标志物Brachyury(T),EOMES,MIXL1和GSC,以及分化后期的DE分子标志物SOX17和FOXA2的mRNA表达水平相比对照组显著降低(全部P<0.05)。并且,在DE分化过程中,敲低DANCR组的WNT通路的转录活性相比对照组显著降低(P<0.05),表现为WNT通路下游基因FZD5,FZD8,SFRP1,FRZB和ANKRD6 mRNA表达水平明显减少(P<0.05)。然而,敲低DANCR对TGFβ通路的SMAD2/3和p-SMAD2蛋白表达水平没有显著影响(P>0.05)。人为激活细胞内β-CATENIN蛋白活性,能够有效回补由于敲低DANCR导致的DE分化缺陷。【结论】DANCR在DE分化过程中逐渐下调并促进DE分化发生,DAN⁃CR可能通过与WNT通路相互作用参与调控hESC向DE分化。

骨髓间质干细胞抑制肝星状细胞增殖与活化的体外研究

目的:探讨骨髓间质干细胞(MSCs)对活化态肝星状细胞(HSCs)增殖的影响。方法:分别从骨髓和肝脏分离纯化培养大鼠MSCs及HSCs,塑料板传代培养激活HSCs;在半透膜(transwellinsert)上接种MSCs,在6孔塑料培养板上接种HSCs,建立上下双层细胞共培养体系;大鼠正常肝细胞系(BRLs)及HSCs培养分别作为对照。免疫细胞化学检测平滑肌激动蛋白(α-SMA)与结蛋白的表达,IBAS2.5软件分析阳性染色表达量。结果:HSCs与MSCs共培养24h,HSCs表现轻度增殖抑制,随着培养时间延长,HSCs增殖活性受抑制更明显,在48h和72h的抑制率分别达15.7%与30.3%,与BRLs共培养体系比较有显著差异;与MSCs共培养72h,HSCs表达α-SMA量明显低于两个对照组BRLs及HSCs培养体系(50.2%vs90.2%、95.6%,P<0.01);而结蛋白表达的量在3组共培养体系中均无显著差异。结论:MSCs具有分泌细胞因子抑制HSCs增殖活性的潜能,在治疗肝纤维化中可能发挥作用。

胎肝条件培养液体外诱导人骨髓间充质干细胞定向分化为造血细胞的研究

目的探讨人骨髓间充质干细胞(hMSCs)体外造血分化潜能。方法选用孕125-145d(125-145dpc)的昆明小鼠,分别制备小鼠胎肝基质细胞条件培养液(FLSC-CM)及胚胎成纤维细胞饲养层(FD),将体外扩增的CD34-CD45-hMSCs分别接种于含FLSC-CM、FD和IL-6及SCF组合的培养体系中,培养7d后,通过形态学、表型、粒-单/巨噬细胞系集落培养(CFU-GM)对分化细胞进行鉴定。结果hMSCs与FLSC-CM共培养组产生的非贴壁细胞明显增多,形态类似于单核或小淋巴细胞,部分细胞可表达人造血细胞特异性表面分子(CD34和CD45),在含人粒-单集落刺激因子(GM-CSF)的甲基纤维素培养体系中能够形成CFU-GM,而FD和IL-6+SCF诱导组无上述作用。结论FLSC-CM可诱导CD34-CD45-hMSCs分化为造血细胞,提示hMSCs具有体外造血分化潜能。

NT-3基因修饰及维甲酸预诱导的骨髓间充质干细胞在脊髓损伤处分化为神经元样细胞的研究

目的探讨移植在脊髓损伤处的神经营养素-3(NT-3)基因修饰及维甲酸(RA)预诱导的骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为神经元样细胞的潜能。方法将MSCs、RA诱导的MSCs、LacZ基因修饰的MSCs、NT-3基因修饰的MSCs和NT-3基因修饰及RA预诱导的MSCs分别立即移植到脊髓全横断处(T10脊髓),术后67d取材和冷冻切片,用免疫荧光组织化学染色方法检测MSCs的分化潜能,计算各细胞移植组脊髓损伤处的MSCs分化为神经元样细胞的百分率。结果移植的MSCs在受损伤的脊髓内可分化为神经干细胞(nestin阳性)、神经胶质样细胞(GFAP阳性)和神经元样细胞(NF和MAP2阳性),有些还可以向含有某种神经递质和有形成突触潜能的神经元样细胞分化(ChAT、5-HT和PSD95阳性)。联合应用NT-3基因修饰和RA预诱导的MSCs能在受损伤的脊髓内更有效地提高MSCs向神经元样细胞分化的百分率。结论NT-3基因修饰和RA预诱导的MSCs能在脊髓损伤处更好地分化为神经元样细胞。

胎儿骨髓间充质干细胞生物学特性的研究

目的:分离培养胎儿骨髓间充质干细胞(fetus mesenchymal stem cells,fMSCs),分析其基本的生物学特征,如形态特征、增殖特性、细胞表型和多向分化潜能以及核型分析等,为其临床应用提供理论依据。方法:淋巴细胞分离液分离胎儿骨髓MSCs,在相同条件下分别考察各代细胞形态、生长、表面标记的变化情况,并进行不同生长时期的核型分析、细胞周期检测等。结果:在扩增过程中,MSCs的增殖能力随着代数增加而降低。在扩增至第3代时,MSCs表现出较高的纯度,表达CD29、CD44、CD105、CD166,不表达CD34、CD45。10代之前核型未发生变异,仍具成骨成脂分化能力,细胞周期分析显示其仍具有干细胞特性。结论:在体外培养条件下,10代以前的细胞生长性状稳定,可作为组织工程等临床应用的良好对象。

成年比格犬骨髓间质干细胞体外软骨方向分化的实验研究

目的:体外诱导成年比格犬骨髓间质干细胞(BMSCs)定向分化为软骨细胞,探讨体外诱导成软骨的方法和条件。方法:比格犬股骨取骨髓10 mL,体外行原代和传代培养扩增,加入转化生长因子(TGF-β1),以高密度细胞团块培养,诱导BMSCs分化为软骨细胞。甲苯胺蓝染色检测软骨基质的分泌,免疫组织化学染色检测软骨特异性Ⅱ型胶原表达。结果:诱导的软骨样组织甲苯胺蓝染色阳性;Ⅱ型胶原免疫组织化学检测阳性。结论:应用含TGF-β1的诱导液在体外可以诱导比格犬BMSC分化为软骨细胞,诱导的软骨细胞可作为软骨组织工程较理想的种子细胞。

成纤维细胞与间充质干细胞来源外泌体修复急性皮肤创面的比较

【目的】本研究旨在比较成纤维细胞来源外泌体与间充质干细胞来源外泌体对小鼠急性皮肤创面的修复作用。【方法】体外分离培养原代人真皮成纤维细胞(hDF)并鉴定。用超速离心法提取人真皮成纤维细胞来源外泌体(hDF-EXO)、人骨髓间充质干细胞来源外泌体(hMSC-EXO)并鉴定;两种外泌体与hDF共培养24 h后,CCK8细胞增殖实验和划痕实验检测细胞增殖和迁移活性;采用8周龄雌性C57BL/6小鼠构建急性全层皮肤切除模型,在伤口上分别局部涂敷PBS(对照组)、hDF-EXO、hMSC-EXO进行治疗。术后第0、2、4、7天观察小鼠伤口并计算伤口面积。术后第1天取伤口组织检测对外泌体摄取情况,并利用qPCR检测伤口组织TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-10炎症因子水平。术后第7天取伤口组织进行HE染色观察伤口组织结构变化,免疫荧光染色观察伤口组织PDGFR-α、α-SMA、Ki67表达情况。【结果】hDF表面分子及特异性标志物表达符合成纤维细胞特性。hDF-EXO和hMSC-EXO的形状、粒径、标志物均符合外泌体鉴定标准,且两者浓度差异无统计学意义(P>0.05);体外试验数据显示,CCK8法检测显示hDF-EXO组和hMSC-EXO组的细胞活力均显著高于对照组(P<0.01),且hDF-EXO组的细胞活力明显高于hMSC-EXO组(P<0.01)。划痕实验显示,hDF-EXO组24 h划痕面积修复率显著高于对照组(P<0.01)和hMSC-EXO组(P<0.05);体内试验数据显示,术后第1天,观察到两种外泌体均被移植周围组织摄入。qPCR检测hDF-EXO组和hMSC-EXO组伤口组织TNF-α、IL-6、IL-1β炎症因子水平均显著低于对照组(均P<0.01),且hMSC-EXO组炎症因子水平低于hDF-EXO组(均P<0.01)。术后第7天hDF-EXO组和hMSC-EXO组伤口面积均显著小于对照组(均P<0.01),且hDF-EXO组伤口面积小于hMSC-EXO组(P<0.05)。HE染色显示,与对照组相比,hMSC-EXO组小鼠伤口残留血痂,表皮不连续,仅有部分新生纤维组织。hDF-EXO组小鼠实现了更快的伤口再上皮化,表皮连续性好,新生纤维组织排列整齐。免疫荧光染色显示,hDF-EXO组和hMSC-EXO组相比对照组,成纤维细胞、肌成纤维细胞及增殖细胞数量显著增多,且hDF-EXO组明显多于hMSC-EXO组。【结论】两种外泌体均能有效促进创面愈合,hDF-EXO通过显著促进成纤维细胞增殖、迁移以及分化为肌成纤维细胞(FMT)加速伤口修复,且其修复作用优于hMSC-EXO。而hMSC-EXO相较于hDF-EXO在伤口早期可发挥更佳的炎症抑制作用。

人诱导多能干细胞向外周神经元分化的实验研究

【目的】探讨人诱导多能干细胞(hiPS细胞)在体外向外周神经元分化的能力。【方法】人诱导多能干细胞在无饲养层培养条件下维持培养,然后在神经培养基中悬浮培养分化为神经球,通过把神经球贴壁在多聚赖氨酸和层粘连蛋白包被的培养板上,利用流式分选细胞方法获得神经嵴干细胞(NCSC),通过把神经嵴干细胞在外周神经诱导培养基中诱导分化,获得外周神经元,利用免疫荧光染色的方法检测神经嵴干细胞和外周神经元的标记物。【结果】贴壁的神经球出现特征性的神经花环(Neural rosettes)结构,神经嵴干细胞从神经花环发生迁移;神经嵴干细胞向外周神经元诱导后出现神经丝结构,并表达外周神经元特异性标记物。【结论】人诱导多能干细胞在体外能高效向外周神经元分化。

人骨髓间充质干细胞体外扩增的生物学评估

本研究旨在对骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells,MSC)进行移植前增殖分化能力测定,病毒学检查,核型分析,PCR-STR和HLA的检测,以便为临床应用提供安全、可靠的移植细胞。采用贴壁法分离骨髓MSC,在相同条件下分别考察各代细胞形态、生长、表面标记、成骨、成脂分化能力的变化情况,并进行不同生长时期的核型分析,利用HLA-SBT技术检测4个不同供者来源的MSC的HLA-I和HLA-II位点的高分辨分型;应用PCR-STR技术检测4个不同供者来源的MSC基因遗传标记。并且利用ELISA方法检测HIV,HBV,HCV和TP,使用PCR方法检测支原体污染。结果表明:随着传代次数增加,MSC的增殖能力、成骨能力均有所下降。在扩增过程中,MSC始终保持较高的纯度,CD29、CD44、CD105、CD166、CD73均表达阳性,CD14、CD34、CD45、CD80和CD86均表达阴性。在8代以前未发现核型变异。4个不同供者来源的MSC的HLA高分辨分型和STR基因分型结果为MSC3的TP表达阳性,MSC2在5代出现支原体污染。结论:在体外培养过程中MSC干细胞特性逐渐丢失,其中向成骨方向的分化潜能降低。MSC在8代以前可作为实验研究及临床应用的良好对象。

人神经干细胞移植对脊髓损伤大鼠后肢运动功能恢复的影响

目的:探讨人神经干细胞(hNSCs)移植对脊髓损伤大鼠后肢运动功能恢复的影响及可能机制。方法:取2～3个月流产胎儿海马区组织,体外培养神经干细胞;采用通用型脊髓打击器将24只成年SD大鼠制成脊髓损伤模型,伤后第8天随机分为移植组和对照组,于损伤中心分别注入CM-DiI标记的hNSCs悬液和DMEM/F12培养液。分别于hNSCs移植后当天及1、2、3、4、6、8周采用Basso,Beattie,Bresnahan(BBB)行为功能评定量表评估大鼠后肢运动功能恢复情况。移植后第4、8周取损伤部位脊髓,行病理切片,免疫组化方法观察移植细胞的存活和迁移,并检测损伤脊髓处胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、神经元核心抗原(NeuN)、2,3-环核苷酸磷酸二酯酶(CNPase)、神经巢蛋白(Nestin)等抗原的表达。结果:移植组后肢运动功能评分随时间延长而逐渐升高,移植1周时后肢运动功能有所改善,与对照组无明显差异(6.4±0.99 vs 6.0±0.93,P>0.05);移植4周时后肢运动功能比1周时有明显恢复,BBB评分明显高于对照组(9.7±1.04 vs 7.4±0.95,P<0.05);移植的hNSCs可在损伤脊髓处长时间存活(至少8周),并分化为神经元、少突胶质细胞和星形胶质细胞。结论:人神经干细胞可在损伤脊髓处向神经元和神经胶质细胞分化,并能促进脊髓损伤大鼠后肢运动功能的部分恢复。

大鼠骨髓间质干细胞体内诱导肝星状细胞的凋亡

背景:骨髓间质干细胞治疗肝纤维化的疗效已得到很多实验的证实,但其机制仍不明确。目的:实验观察骨髓间质干细胞移植后肝星状细胞的凋亡情况,初步探讨骨髓间质干细胞治疗肝纤维化的机制。方法:连续8周皮下注射CCl4诱导大鼠肝纤维化。造模成功后,20只大鼠随机分为实验组及对照组,每组10只。实验组经尾静脉注射骨髓间充质干细胞,对照组经尾静脉注射DMEM培养液。于移植前,移植后第3,7天分别处死大鼠,取其肝脏行羟脯氨酸的检测,苏木精-伊红染色及masson染色,免疫组织化学检测α-SMA及α-SMA+TUNEL双染反映肝星状细胞活化及其凋亡情况。结果与结论:造模8周后,大鼠肝脏羟脯氨酸含量明显升高,病理呈进展性肝纤维化表现。移植7d后,实验组大鼠肝脏羟脯氨酸含量明显降低,肝纤维化有所缓解,而对照组的肝纤维化程度继续加重。免疫组织化学显示,CCl4注射8周后,α-SMA阳性细胞大量增生,移植后第7天,实验组α-SMA阳性细胞明显少于对照组(P<0.05)。移植后第3天,实验组肝星状细胞凋亡明显较对照组增加(P<0.05)。结果提示,骨髓间质干细胞移植有治疗肝纤维化的作用。骨髓间质干细胞诱导肝星状细胞凋亡可能是其治疗肝纤维化的主要机制之一。

骨髓间充质干细胞两种示踪方法的优缺点比较

【目的】探讨荧光染料CM-DiI直接标记和慢病毒感染法EGFP标记人骨髓间充质干细胞(hMSC)用于体内示踪的优缺点。【方法】利用FUGW质粒构建携带EGFP基因的慢病毒载体,并感染P3代hMSC,荧光倒置显微镜下观察细胞的感染效果及传代前后细胞EGFP表达情况的变化;CM-DiI直接标记P3代hMSC,观察CM-DiI标记对细胞生物学特性的影响及传代前后细胞标记效果的变化。分别将CM-DiI和EGFP标记的P3代hMSC移植入新生大鼠左侧脑室,2周后取大鼠脑组织行冰冻切片,比较两种标记方法用于体内示踪的效果。【结果】慢病毒感染hMSC 48h后,约40%细胞表达绿色荧光,体外培养1个月,EGFP阳性细胞数增至50%左右,荧光强度基本保持不变,细胞生长不受病毒转染的影响。CM-DiI标记hMSC 12h后,95%以上细胞呈现很强的红色荧光,1个月后,阳性细胞减少至50%左右,荧光强度也有一定程度降低,未见染料对细胞形态和生长产生明显影响。CM-DiI标记的hMSC移植后2周脑冰冻切片可以找到红色荧光的标记细胞,EGFP标记的hMSC移植后2周脑冰冻切片未找到绿色荧光细胞。【结论】CM-DiI和EGFP均可在体外高效标记hMSC,但CM-DiI标记的hMSC体内示踪效果优于EGFP标记。

骨髓间质干细胞抑制大鼠肝纤维化形成的可能性:受体肝内干细胞存活时间、肝星状细胞活化程度及生存分析的7周观察

目的:观察在体外培养条件下,具有强大的增殖和分化为肝细胞能力的骨髓间质干细胞输注治疗肝纤维化模型大鼠对其肝纤维化形成的影响及肝功能和生存分析,并对治疗组、空白对照组和病理对照组7周内的相关情况予以对照比较。方法:实验于2003-08/2004-10在中山大学基础医学院病理学于病理生理实验室完成。①动物分组:选用雄性6周龄Wistar大鼠5只为供体,供分离骨髓间质干细胞;雌性6周龄Wistar大鼠60只,其中50只被造成肝纤维化模型,在首次用二甲基亚硝胺处理后的第10天,将造模大鼠随机分为2组:骨髓间质干细胞治疗组10只(为受体),于治疗39d后结束实验,取材分析病理对照组40只。另10只作为空白对照组(仅静脉注射生理盐水)。②肝纤维化模型制作:在实验的当天,给予10g/L二甲基亚硝胺溶液(生理盐水配置)1mL/kg,腹腔注射,每周连续3次,共6周。③骨髓间质干细胞治疗组:每只大鼠输注3×106个骨髓间质干细胞;病理对照组:使用等体积生理盐水代替骨髓间质干细胞。④动物的一般生活状态:每天观察饮食、活动、二便、体质量、皮毛、呼吸情况等。⑤肝脏的组织细胞形态结构:将肝组织以苏木精-伊红染色后观察。⑥肝星形细胞及其活化程度检测:前者检测肝脏α-平滑肌肌动蛋白含量,用免疫组织化学染色法,后者以德国IBAS2.5图像分析软件半定量分析。⑦肝脏胶原分布的相对含量检测:采用Masson三色染色法,从而反映肝纤维化程度。⑧肝脏羟脯氨酸含量测定:采用氯胺T法。⑨血清总胆红素和谷丙转氨酶水平检测:采用全自动生化分析仪。⑩血清层粘蛋白和透明质酸水平测定:采用放射免疫法。瑏瑡雄性大鼠骨髓间质干细胞在雌性大鼠肝内的Y染色体性别决定区基因的表达检测:采用聚合酶链式反应。瑏瑢统计学分析:两组样本均数比较采用t检验;多组样本均数比较采用方差分析,两两比较采用q检验;生存分析采用Ka-plan-Meier法。结果:雌性大鼠60只进入结果分析。①实验动物生存状况:造模6周后,骨髓间质干细胞治疗组生存率为80%,而病理对照组生存率为10%,空白对照组生存率为100%,说明骨髓间质干细胞治疗可能通过阻止肝纤维化发展,从改而善大鼠的生存率。②肝脏组织学显示,骨髓间质干细胞治疗组的肝脏结构明显改善,炎症减轻、假小叶结构减少或消散。相反,病理对照组出现广泛的肝脏结构重塑,包括增厚的纤维间隔形成和明显的桥接坏死。半定量分析胶原染色,骨髓间质干细胞治疗组较病理对照组显著减低(8.12±1.98,15.71±2.13,t=6.11,P<0.05)。③肝脏星状细胞活化的标志α-平滑肌激动蛋白的阳性表达:空白对照组仅见血管壁有少量α-平滑肌激动蛋白的阳性表达,而病理对照组和骨髓间质干细胞治疗组可见在纤维间隔、肝窦和汇管区内明显表达。半定量分析α-平滑肌激动蛋白的阳性染色,骨髓间质干细胞治疗组较病理对照组显著减低(11.06±2.03,18.50±3.87,t=4.47,P<0.05)。④Y染色体性别决定区基因的表达:经雄性Wistar大鼠(供体)骨髓间质干细胞治疗39d的雌性大鼠,肝脏DNA经聚合酶链式反应检测结果显示,Y染色体性别决定区基因的表达阳性,而空白对照组和病理对照组则无此阳性信号。说明骨髓间质干细胞移植后,能够在受体肝内存活5周以上。⑤反映肝脏纤维化程度的肝脏羟脯氨酸含量及血清层黏蛋白和透明质酸水平:骨髓间质干细胞治疗组明显高于空白对照组(P<0.05)但明显低于病理对照组(P<0.05),说明骨髓间质干细胞治疗后能够减少肝脏胶原蛋白的含量,从而减少肝纤维化的形成,使肝纤维化得到控制。⑥反映肝功能的血清总胆红素、谷丙转氨酶水平:骨髓间质干细胞治疗组明显低于病理对照组(P<0.05),接近空白对照组。说明了骨髓间质干细胞治疗有助于改善肝功能状态。结论:①二甲基亚硝胺能成功诱导大鼠肝纤维化模型的建立。②骨髓间质干细胞可改善肝纤维化大鼠的生存状况和肝功能。③骨髓间质干细胞能够减少肝脏胶原蛋白的产生,抑制肝纤维化形成。④肝纤维化发生发展过程中活化态的肝星状细胞数量减少可能是骨髓间质干细胞抑制肝纤维化形成的原因之一。⑤雌性大鼠肝脏内存在雄性供体Y染色体性别决定区基因的信号说明骨髓间质干细胞能够在受体肝内存活5周以上。

氯甲基苯甲酰氨荧光染料标记大鼠骨髓间质干细胞的体内示踪

背景:目前广泛应用于骨髓间质干细胞的标记方法主要为绿色荧光蛋白标记法,但标记与固定程序复杂,操作繁琐,易出现偏差。氯甲基苯甲酰氨(Chloromethyl-benzamidodialkylcarbocyanine,CM-Dil)是亲脂性膜荧光染料,能够与含有肽和蛋白质的硫氢基结合进而标记整个细胞。目的:探讨CM-Dil对大鼠骨髓间质干细胞体内示踪的可行性。设计、时间及地点:体内外细胞学观察,于2007-05/12在中山大学干细胞与组织工程研究中心、中山大学动物实验中心完成。材料:SPF级Wistar大鼠40只,由中山大学实验动物中心提供。CM-Dil为美国Sigma公司产品。方法:在体外,以标记CM-Dil的骨髓间质干细胞作为实验组,以未标记CM-Dil的骨髓间质干细胞作为对照组,比较两组细胞生长与增殖情况,MTT法检测细胞生长增殖情况。在体内,分别将标记CM-Dil的骨髓间质干细胞经门静脉移植及肝内培养,于移植后第7,15,21,30天制备肝脏切片。主要观察指标:骨髓间质干细胞CM-Dil标记率,标记细胞在肝内定植、生长与分布。结果:体外培养结果显示,两组骨髓间质干细胞在细胞生长、增殖、分裂以及形态学上均基本相似,在绿色光激发下,CM-Dil发出红色荧光,24h后细胞标记率为100%,21d后CM-Dil标记的骨髓间质干细胞荧光开始淬灭。体内实验中,经门静脉移植的骨髓间质干细胞在肝脏内主要位于间质,呈椭圆形或不规则形的分化细胞;肝内培养的骨髓间质干细胞在培养孔内呈"贴壁生长",为椭圆形分化细胞,未发现骨髓间质干细胞进入并定植于肝组织内;CM-Dil标记的骨髓间质干细胞荧光开始淬灭的时间亦为21d。结论:CM-Dil染色简单、方便、稳定,荧光开始淬灭时间较长,可望成为大鼠骨髓间质干细胞体内示踪的新方法。

心肌营养素1诱导骨髓间充质干细胞分化为心肌样细胞

目的:探索心肌营养素1(CT-1)对小型猪骨髓间充质干细胞(MSCs)向心肌样细胞分化的影响。方法:获取、扩增稳定的成体西藏小型猪MSCs,鉴定成脂、成骨潜能。分4组诱导向心肌样细胞分化,包括空白对照组、5-氮杂胞苷(5-Aza)组、CT-1组、5-Aza和CT-1合用组。取诱导后4周的细胞加肌动蛋白(α-actin)和心肌肌钙蛋白T(cTnT)抗体,进行免疫荧光染色,最后计数红色荧光阳性染色率。结果:分组诱导分化结果,合用组的诱导分化心肌样细胞α-actin阳性率为29.90%±4.76%,明显大于5-Aza组(17.73%±2.35%,P<0.01)、CT-1组(6.63%±0.55%,P<0.01)和空白对照组(1.62%±0.09%,P<0.01);5-Aza组明显大于CT-1组(P<0.01)和空白对照组(P<0.01);CT-1组明显大于空白对照组(P<0.05)。cTnT红色荧光染色结果显示:合用组的诱导分化心肌样细胞cTnT阳性率为36.50%±4.09%,明显大于5-Aza组(14.37%±1.65%,P<0.01)、CT-1组(7.50%±0.61%,P<0.01)和空白对照组(1.12%±0.23%,P<0.01);5-Aza组明显大于CT-1组(P<0.01)和空白对照组(P<0.01);CT-1组明显大于空白对照组(P<0.01)。结论:适宜浓度的5-Aza(10μmol/L)和CT-1(0.1μg/L)能够在体外诱导小型藏猪骨髓MSCs转化为心肌样细胞,诱导后的细胞获得部分心肌细胞特异性蛋白的表达。CT-1与5-Aza联合可明显提高诱导率。

Microdystrophin基因重组腺病毒的构建及转染mdx骨髓间充质干细胞的表达

构建含有人microdystrophin基因的重组腺病毒,来感染dystrophin基因敲除小鼠mdx的骨髓间充质干细胞(MSC)进行基因修饰,为同种异体基因修饰的干细胞移植治疗DMD疾病奠定基础。用NotⅠ酶切含microdystrophin基因的pBSK-MICRO质粒,获得microdystrophin基因。片段回收后定向插入腺病毒穿梭质粒pShuttle-CMV,获得重组质粒pShuttle-CMV-MICRO。PmeⅠ线性化重组质粒pShuttle-CMV-MICRO,去磷酸化后回收后与腺病毒骨架质粒pAdeasy-1共电转化BJ5183感受态细胞。同源重组后用选择性培养基筛选阳性克隆,提取质粒,用脂质体介导转染293细胞,通过观察293细胞病变及PCR扩增目的基因等方法鉴定重组的腺病毒。然后将病毒上清转染DMD模型鼠mdx小鼠的骨髓间充质干细胞,通过RT-PCR以及间接免疫荧光检测microdystrophin的转录及蛋白表达。成功构建了含有microdystrophin基因的重组腺病毒,病毒滴度为5·58×1012vp/mL。间接免疫荧光检测可见microdystrophin蛋白在mdx小鼠MSCs中高效表达。该重组腺病毒载体的构建及成功转染到mdxMSCs内表达为下一步用microdystrophin基因修饰的mdxMSCs进行同种异体移植治疗DMD疾病奠定了基础。

神经干细胞神经分化示踪中GFAP启动子驱动荧光报告系统的价值

背景:神经干细胞作为近年来神经科学研究的热点,在神经系统损伤治疗方面具有广阔的应用前景,但如何获取大量纯化且特征均一的终末神经细胞是这一领域的难点。利用细胞内荧光报告系统示踪神经干细胞分化的过程,并获得纯化的单一类型终末神经细胞为这一难点的解决提供了可行的方案。目的:探讨携带星形胶质细胞特异标志物GFAP基因的启动子驱动的荧光报告系统在神经干细胞神经分化示踪中的价值。方法:原代分离小鼠胚胎的脑部皮质,经机械消化和吹打后悬浮培养,免疫荧光染色检测其特异标志物Nestin的表达以确定神经干细胞。再将携带pL V/Final-neo-GFAP(promoter)-dT omato载体的慢病毒感染小鼠神经干细胞,遗传霉素G418筛选14 d后获得纯化神经干细胞,然后诱导其向星形胶质细胞分化,显微镜观察细胞红色荧光(dT omato)的变化。诱导第13天采用细胞免疫荧光技术对表达红色荧光的细胞行GFAP抗体复染。结果与结论:(1)原代分离获得的小鼠神经干细胞呈Nestin表达阳性;(2)慢病毒感染并筛选14 d后得到具有G418抗性的纯化神经干细胞;(3)该细胞经神经诱导分化后,显微镜下观察到红色荧光大量表达,且GFAP复染与红色荧光具有非常高的一致性;(4)实验成功地获得了体外表达neo-GFAP(promoter)-dT omato载体的小鼠神经干细胞,该细胞可以体外示踪GFAP基因的特异表达,为神经干细胞的定向神经分化机制、细胞移植及组织工程产品开发等研究提供了有力的工具。

人微小抗肌萎缩蛋白基因转染大鼠骨髓间充质干细胞及其基因表达

目的构建人微小抗肌萎缩蛋白基因(microdystrophin)的真核表达载体,转染大鼠骨髓间充质干细胞(rMSC),研究其体外表达情况。方法限制性酶切PBSK-MICRO质粒的微小抗肌萎缩蛋白基因片段,插入到真核表达质粒pcD-NA3.1(+)的NotI位点内,克隆出真核表达载体pcDNA3.1(+)/micro dystrophin。通过酶切和测序对质粒进行鉴定。用脂质体将重组质粒转染入rMSCs中,经过G418筛选后,用RT-PCR及间接免疫荧光技术检测表达产物。结果pcDNA3.1(+)/micro dystrophin经过NotI、Hind III酶切鉴定及测序证实插入片断正确。提取转染重组质粒rMSCs的总RNA,进行RT-PCR可见mRNA的转录;对G418筛选后rMSCs进行免疫荧光检测可见细胞内亮丽的红色荧光,说明转染后的rMSCs有微小抗肌萎缩蛋白的表达。结论成功构建了人microdystrophin基因真核表达载体,将其转染入rMSCs内有微小抗肌萎缩蛋白的表达,为进一步研究体外修饰自体干细胞移植治疗DMD奠定了基础。

PCR-STR用于异基因造血干细胞移植后的骨髓和外周血嵌合状态的监测及作用

目的用PCR-STR检测观察比较异基因造血干细胞移植术后,骨髓和外周血嵌合状态和植入状态。方法提取17例异基因造血干细胞移植术中的供者外周血及受者移植前后各阶段外周血和骨髓的DNA,PCR PCR-STR检测扩增15个基因位点,和1个性别位点AMEL。用遗传分析仪进行毛细管电泳,确定基因位点,根据基因型的差异选择嵌合率计算公式,分析植入情况和嵌合状态。结果12名患者完全植入,骨髓和外周血的PCR-STR结果一致;1名患者骨髓PCR-STR显示为持续未植入,外周血PCR-STR显示为短期混合植入;4名患者骨髓和外周血PCR-STR显示嵌合状态时间不一致,骨髓PCR-STR显示嵌合状态时间明显早于外周血(P<0.05)。结论PCR-STR是分析异基因造血干细胞移植后供体是否植入的灵敏、准确度高的方法,骨髓嵌合状态的变化的出现早于外周血,混合嵌合状态对白血病复发有预警作用,骨髓嵌合状态的早期变化对实施临床干预治疗尤为重要。