转突变型A53Tα-突触核蛋白基因的帕金森模型小鼠中脑的全基因组甲基化测序分析

[目的]研究帕金森氏病(PD)致病基因SNCA在A53T位置突变后对转基因小鼠中脑多巴胺,神经元DNA甲基化修饰的影响。[方法]分别取转突变的人源α-突触核蛋白(hα-syn)即hA53Tα-syn基因小鼠和对照组小鼠的中脑组织,采用重亚硫酸盐测序法(BS-seq)分别对12月龄的转基因小鼠和非转基因(nTg)小鼠进行全基因组甲基化分析,随后筛选出差异甲基化区域(D MR)用于GO富集分析。[结果]通过对比分析,我们总计发现481个DMR,其中高甲基化与低甲基化DMR分别有257和224个,包括与泛素降解途径相关的Ubqln2、HECTD4、Rnf157基因,丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶PINK1等基因。富集结果显示,差异甲基化基因总共映射到545个GO子条目,且主要富集于解剖结构发育、树突发育、神经系统发育、神经元投射等条目。[结论]帕金森致病基因SNCA在A53T位置的突变可诱导小鼠中脑多巴胺神经元DNA甲基化改变。

构建具有突触传递潜能的iPSC源性抑制性神经网络组织

【目的】利用人诱导多能干细胞(hiPSCs)定向分化为γ-氨基丁酸能(GABA)神经前体细胞后种植到脱细胞视神经(DON)材料内,以构建出具有突触形成潜能的hiPSC源性抑制性神经网络组织。为研究与治疗修复中枢神经系统损伤提供一种新的组织工程产品。【方法】采用分步定向诱导和组织工程构建技术相结合的方法。将hiPSCs体外定向诱导为GABA能神经前体细胞(hNPCs)后,种植于DON材料上三维培养,在特定神经元诱导环境下,将其进一步分化为GABA能神经元。应用透射电镜和全细胞膜片钳技术分别检测hiPSCs分化的神经元之间能否形成类突触结构,以及这些神经元是否具有自发性抑制性突触后电流。从结构与功能角度证实这些hiPSCs分化的神经元可形成具有突触传递潜能的抑制性神经网络组织。【结果】在体外将hiPSCs成功诱导出GABA能表型的抑制性神经元,且其培养28 d仍保持良好活力。透射电镜下,观察到三维材料上hiPSC源性神经细胞突起之间形成许多的细胞连接,其中一些为类突触样结构,表现为:一侧细胞突起的细胞膜稍增厚并且其内侧面胞质含有少量囊泡,形成类突触前成分的结构;其对侧为另一个细胞突起的细胞膜局部增厚,形成类突触后膜的结构。全细胞膜片钳检测可记录到已分化的hiPSC源性神经细胞具有产生动作电位和自发性抑制性突触后电流的能力。【结论】本研究结果表明,在体外诱导hiPSCs定向分化为GABA能神经前体细胞后种植到DON材料内三维培养,可成功构建成具有突触传递潜能的hiPSC源性抑制性神经网络组织,这将为后期研究与治疗中枢神经系统损伤提供一种新型干细胞组织工程来源的神经组织。

食欲素B增强外膝体纤维投射至视皮层第6b层锥体细胞的突触传递

[目的]探究食欲素B(Orexin B)调控外膝体(LGN)纤维投射至视皮层(visual cortex,VC)第6层b亚层(L6b)中的食欲素B敏感神经元(Orexin敏感神经元)的突触传递作用.[方法]选用P25~P30的C57小鼠,脑立体定位注射CTB555或者ChR2-EGFP,分别标记VC中L6b反馈投射到LGN的神经细胞和源自LGN前馈投射至L6b的神经纤维.膜片钳的方法记录CTB555标记的L6b中的神经细胞的突触后电流(EPSC),电刺激皮层白质或蓝光刺激ChR2-EGFP(Channelrhodopsin 2-Enhanced Green Fluorescent Protein)标记的LGN投射到VC的神经纤维.[结果]从L6b反馈投射至LGN的神经细胞中,92.5%为锥体神经元,且这些锥体神经细胞中有63.3%的细胞对Orexin B受体激动剂敏感.电刺激或光刺激LGN前馈投射至L6b的神经纤维,Orexin B增强L6b中Orexin敏感细胞的突触后NMDAR电流[电刺激:(125.1±3.7)%,光刺激:(123.8±3.8)%,在OX2R阻断剂的存在下,Orexin B对突触后电流振幅的效应消失,具有明显统计学意义,P<0.05],因此,OrexinB增强LGN——Orexin敏感神经细胞之间的突触传递.[结论]Orexin B增强外膝体(LGN)纤维投射至视皮层L6b中的锥体细胞之间的突触传递.

食欲素B增强视皮层第2/3层传入到第6b层锥体神经细胞的突触传递

【目的】研究小鼠视皮层第6b层中对食欲素(Orexin B)敏感的神经元的细胞类型以及食欲素调控其敏感神经元中来自第2/3层传入的突触传递和机制。【方法】用生物细胞素(biocytin)标记小鼠视皮层第6b层中被Orexin B受体激动剂直接兴奋的神经细胞,双光子显微镜下观察这些神经元的细胞形态;外膝体注射逆行标记荧光染料(CTB555)标记小鼠视皮层第6b层中反馈投射到外膝体的神经元,电刺激视皮层第2/3层传递到第6b中由CTB555标记的、反馈投射到外膝体的神经元的传入神经通路,并记录兴奋性突触后电流(EPSC)。【结果】在视皮层第6b层中58.1%的锥体细胞和52.9%的多极细胞是Orexin B敏感的神经元;Orexin B能增强第6b层中经CTB555标记的、反馈投射到外膝体的神经元中来自第2/3层的传入纤维的突触传递。这种增强作用可分别被Orexin B2型受体阻断剂[Ctr:(119.33±2.51)%,n=15 cells,7 mice;TCS OX229:(103.17±2.75)%,n=30 cells,10 mice;P<0.001]、磷脂酶C抑制剂[Ctr:(125.51±1.4)%,n=11 cells,5 mice;U173332:(103.89±1.04)%,n=10 cells,5 mice;P<0.001]、细胞内Ca2+螯合剂[Ctr:(125.54±1.53)%,n=11 cells,5 mice;BAPTA:(102.86±1.7)%,n=9 cells,4 mice;P<0.001]和mGluR5受体拮抗剂所阻断[Ctr:(126.14±3.87)%,12 cells,5 mice;MPEP:(106.32±2.65)%,n=12 cells,6 mice;P<0.001]。【结论】小鼠视觉皮层第6b层中,大部分锥体神经元和多极神经元是Orexin B敏感的神经元,第6b层中反馈投射到外膝体的神经元细胞膜上的食欲素受体被激活后可以通过激活细胞内磷脂酶C的活性而增强来自第2/3层的传入的突触传递。

外周神经损伤降低背侧海马的突触可塑性导致短期记忆障碍

目的探讨保留性神经损伤(SNI)模型对小鼠背侧海马Schaffer-CA1的突触可塑性及短期记忆功能的影响。方法比较了Sham组和SNI组小鼠的新物体识别记忆(NOR)。用全细胞细胞内记录的方法记录了背侧海马Schaffer侧支到锥体细胞的LTP并比较Sham和SNI模型小鼠背侧海马的N-甲基-D-天冬氨酸受体电流(NMDAR current);用Western blot的方法比较了Sham组和SNI组小鼠背侧海马BDNF的蛋白表达量。结果与Sham组相比,SNI组小鼠新物体识别指数、背侧海马Schaffer-CA1的LTP幅度、NMDAR电流和BDNF的蛋白表达量均有下降(均P<0.05)。结论SNI导致了背侧海马NMDAR依赖的Schaffer-CA1突触可塑性降低,可能导致短期记忆功能受损。