组织学与胚胎学医学教学模式改革初探

目的目前的医学教育课程体系大致可分为3种类型:以学科为中心的传统课程体系、以问题为中心的课程体系(PBL)以及以器官系统定位的课程体系,但这3种课程体系各具优缺点。本研究将这3种方法合理融为一体,去除各自教学方法的缺陷,保留优点,形成独特的教学新法,使之能更好地适合中国医学教育发展,并易于推广应用。方法本研究涉及5年制、8年制医学本科学生和组织学与胚胎学教研室全体教师。课程改革内容由3部分组成:(1)课程内容精讲;(2)相关进展介绍和(3)科研小组活动。结果学生们可以渐进式、系统地牢固掌握基本知识点(正常的人体组织细胞的结构与功能),同时可以了解16个与临床疾病相关的疾病病因与治疗的研究进展现状,并在导师指导下完成某一领域(系统)的课题研究。结论该法兼顾了3种教学课程体系的优点,不需改动任何原有的教学资源,较好地继承和发扬传统教学方法,符合中国国情,具有切实可行性,可以在国内外推广。

留学生组织与胚胎学实验教学的教学方法探讨

随着各高校留学生的招生,留学生教学的研究成为一崭新的课题,其教学模式、教学方法及教学手段等问题都具有极大的探索价值。本文结合在组织胚胎学教学过程中的一些体会,探讨医学院校基础课开展医学留学生全英语教学的经验与体会,并提出了自己的一些建议。

兴奋性hiPSC源性类神经网络组织的构建

【目的】将人诱导多能干细胞源性神经前体细胞(hiPSC-NPCs)种植于去细胞视神经(DON)上,在体外构建一种具有突触传递功能的类神经网络组织,为神经组织损伤的修复提供一种有效途径。【方法】通过定向诱导和组织工程技术,联合应用hiPSCs和3D DON支架,构建一种新的类神经网络组织。定向诱导人诱导多能干细胞(hiPSCs)向人神经前体细胞(hNPCs)及神经元方向分化,使用免疫荧光染色鉴定细胞分化效率。制备3D DON支架,借助扫描电镜、Tunnel染色,鉴定支架形貌及细胞相容性。将诱导的hiPSC-NPCs种植于DON支架中,借助免疫荧光染色、扫描电镜、透射电镜和膜片钳对构建的类神经网络组织进行形态学观察和功能学鉴定。【结果】①免疫细胞化学染色结果提示,诱导的hiPSC-NPCs在体外大部分向神经元方向分化,成功构建了一种以神经元为主的神经网络。②扫描电镜和免疫组织化学结果提示,在体外成功构建了一种以兴奋性神经元为主的类神经网络组织。③免疫组织化学染色、透射电镜和膜片钳结果提示,构建的类神经网络组织能够传递兴奋性突触信息。【结论】利用天然来源的具有均匀孔道分布的DON生物支架材料和hiPSC-NPCs的有机结合,构建了一种以兴奋性神经元为主的具有突触传递功能的类神经网络组织,这种神经网络可作为脊髓损伤(spinal cord injury,SCI)等神经组织损伤后组织替换疗法的有利工具,具有广阔的临床应用前景。

人羊膜定向诱导胚胎干细胞分化为表皮样细胞机理的初步探讨

目的 :初步探讨人羊膜诱导小鼠胚胎干细胞向表皮样细胞定向分化的机理。方法 :小鼠胚胎干细胞与人羊膜在双层 6孔培养板中共培养 4 - 5d ,对照组未加羊膜 ,观察其形态学分化。分别用β1整合素、角蛋白 19/15和套膜蛋白免疫组化检测胚胎干细胞向表皮样细胞的分化。结果 :共培养 4 - 5d后 ,小鼠胚胎干细胞分化为表皮细胞样的单层细胞 ,细胞排列紧密 ,呈多边形 ,免疫组织化学染色显示 ,大部分细胞呈现 β1整合素阳性 ,少数细胞呈角蛋白 19和角蛋白 15阳性 ,未见套膜蛋白阳性细胞 ,对照组大部分细胞死亡 ,存活细胞形态各异 ,未见β1整合素、角蛋白 19/15和套膜蛋白免疫组化染色阳性细胞。结论

高血压机械力诱导血管平滑肌细胞结构与功能变化及其在血管疾病中的作用

血压升高产生的机械力在血管分化与发育、血管正常结构与功能维持以及血管病变过程中起决定作用,血脂和/或血糖异常升高可协同机械力作用加速血管重构及疾病发生发展。机械力可非特异性激活血管细胞所有跨膜蛋白分子,引起细胞内多信号通道分子(第二效应分子)同步活化。多通道信号分子在信号网络结点分子汇集,继而再散发,启动更多信号通路活化,实现信号的级联瀑布放大,导致细胞一系列病理生理学变化如细胞分化、迁移、炎症、表型变化、钙化、增殖、凋亡等,最终引起血管的结构与功能改变如动脉粥样硬化等,成为心脑血管疾病致死、致残的主要原因。本文对本课题组及国际同行相关研究进展,亦即血压升高产生的机械力对血管平滑肌细胞作用相关的血管重构做一简要综述。

盐酸小檗碱通过抑制PKCα磷酸化抑制机械牵张力诱导的血管平滑肌细胞增殖和凋亡

[目的]观察机械牵张力(SS)是否通过激活PKCα诱导小鼠血管平滑肌细胞(VSMC)增殖和凋亡,并探讨盐酸小檗碱(BBR)对它的作用及机制。[方法]实验共分6组:正常对照组、BBR组、PKCα抑制剂(Go6976)组、SS组、SS+BBR组、SS+Go6976组。静息培养的细胞给予BBR或Go6976预处理1 h,继而予10%强度的SS刺激15 min后收集细胞,Western blot检测PKCα和MAPK(ERK、JNK、p38)磷酸化水平。BBR或Go6976预处理1 h,牵拉时间为1 h,继续培养23 h,免疫荧光法检测细胞增殖(Ki67)和凋亡(TUNEL)。[结果]Western blot与免疫荧光结果显示,与正常对照组相比较,SS可升高PKCα和MAPK(ERK、JNK和p38)磷酸化水平(P<0.05),并增加VSMC的增殖和凋亡水平(P<0.05)。BBR可抑制PKCα和ERK、JNK、p38磷酸化水平(P<0.05),同时抑制VSMC增殖和凋亡(P<0.05);Go6976可抑制PKCα和ERK、JNK磷酸化水平(P<0.05),但对p38磷酸化的增加没有影响,同时抑制VSMC增殖和凋亡(P<0.05)。[结论]BBR通过抑制SS诱导的VSMC的PKCα和MAPK磷酸化,抑制VSMC增殖和凋亡。

谷氨酸刺激引起反应性星形胶质细胞分泌CSPGs增加的实验研究

目的 探讨谷氨酸对A1型星形胶质细胞分泌硫酸软骨素蛋白多糖(CSPGs)的影响。方法提取小鼠原代星形胶质细胞培养并将其诱导为A1型星形胶质细胞。用浓度梯度谷氨酸作用于A1型星形胶质细胞72 h后,采用MTT法检测谷氨酸随浓度增加对A1型星形胶质细胞活力的影响、ELISA检测不同浓度谷氨酸及谷氨酸拮抗剂作用于A1型星形胶质细胞72 h后细胞上清中CSPGs的含量。结果 (1)原代培养的星形胶质细胞GFAP阳性率达98%以上;(2)经诱导后原代培养的星形胶质细胞转变为C3阳性的A1型星形胶质细胞;(3)谷氨酸对于A1型星形胶质细胞的活力抑制作用随谷氨酸浓度的升高而增大;(4)经不同浓度谷氨酸作用72 h后,A1型星形胶质细胞上清中CSPGs含量增加,且呈现剂量依赖性;谷氨酸对A1型星形胶质细胞的这种抑制作用可以被谷氨酸受体拮抗剂所抵消。结论 谷氨酸浓度增加会降低A1型星形胶质细胞活力并刺激其分泌CSPGs;通过谷氨酸受体阻断剂可以拮抗谷氨酸对A1型星形胶质细胞的影响。

晚期糖基化终末产物可影响破骨细胞的骨吸收功能

背景:晚期糖基化终末产物对破骨细胞骨吸收功能的影响存在争议,既往多数研究认为其可促进骨吸收,然而另有研究表明其对骨吸收可能呈现抑制效果,但具体机制不清。目的:探究晚期糖基化终末产物对破骨细胞溶解无机骨基质和降解有机骨成分能力的影响及其产生机制。方法:以RANKL对破骨前体细胞RAW 264.7进行定向诱导,在诱导同时加入50-400 mg/L的晚期糖基化终末产物或100 mg/L的牛血清白蛋白,通过观察骨吸收板上溶解坑面积及组织蛋白酶K的表达情况来评估晚期糖基化终末产物对破骨细胞骨吸收功能的影响;并进一步计数抗酒石酸酸性磷酸酶阳性多核细胞数量、计算破骨细胞所含细胞核的数量和检测整合素ανβ3的表达情况。结果与结论:(1)晚期糖基化终末产物组的吸收坑面积和组织蛋白酶K表达量较正常破骨细胞诱导组显著减少,且抑制程度随晚期糖基化终末产物浓度的增高而加重;(2)抗酒石酸酸性磷酸酶染色亦显示抗酒石酸酸性磷酸酶阳性多核细胞数量随晚期糖基化终末产物浓度的增高而显著下降,所含细胞核数量亦减少;(3)实时定量PCR发现整合素ανβ3表达水平随晚期糖基化终末产物作用时间的延长而显著下降;(4)综上结果表明,晚期糖基化终末产物可全面抑制破骨细胞对无机及有机骨基质的吸收功能,其机制可能与晚期糖基化终末产物抑制破骨前体细胞的定向分化、细胞融合及减弱破骨细胞的迁移黏附作用有关。

施万细胞移植促进大鼠脊髓全横断损伤后大脑皮质锥体神经元和红核神经元的存活

[目的]探讨施万细胞移植对大鼠脊髓全横断损伤后大脑皮质感觉运动区神经元和脑干红核神经元存活的影响。 [方法]大鼠脊髓全横断损伤后移植吸附施万细胞的胶原或明胶,术后3个月计数大脑皮质感觉运动区锥体神经元和脑干红核神经元密度以及红核体积。同时以单纯移植胶原或明胶或不移植物体的脊髓损伤大鼠为对照。[结果]脊髓全横断损伤后,大脑皮质感觉运动区锥体神经元密度和脑干红核神经元密度明显较正常大鼠相应区域内的神经元密度降低;移植施万细胞的两个组(胶原施万细胞组和明胶施万细胞组)上述两个区域的神经元密度较未移植施万细胞的3个组(对照组,胶原组和明胶组)高,差异有统计学意义;而移植施万细胞的两个组之间比较或未移植施万细胞的3个组之间比较,上述区域的神经元密度无显著性差异。 [结论]脊髓全横断损伤可导致大脑皮质感觉运动区锥体神经元和脑干红核神经元发生死亡,施万细胞移植能够促进脊髓损伤后大脑皮质感觉运动区锥体神经元和脑干红核神经元的存活。

骨髓间充质干细胞对成年大鼠视网膜节细胞再生的影响

目的:探讨骨髓间充质干细胞(MSCs)对受损成年大鼠视网膜节细胞(RGCs)轴突再生的影响。方法:切断大鼠视神经,缝接自体坐骨神经(AG)。动物分对照组、AG+MSCs组、AG+MSCs+tPNS(三七总皂苷)组。各组动物存活3、4周,用粒蓝逆行标记再生的RGCs,荧光镜下观察视网膜平铺片中再生RGCs的数量变化。免疫组化检测MSCs在玻璃体内的分化。结果:动物存活3、4周,再生的RGCs数目实验组与对照组有显著性差异。AG+MSC组和AG+MSCs+tPNS组,存活的细胞表达Vimentin、NF和GFAP,Laminin无表达。结论:玻璃体植入MSCs可促进受损伤的视网膜节细胞轴突再生。

无功能垂体腺瘤与正常垂体中microRNAs的差异表达

【目的】检测微小分子RNA(microRNA,miRNA)在无功能垂体腺瘤(NFA)和正常垂体(NP)组织中的差异表达,探讨微小分子RNA在垂体腺瘤发生发展过程中的作用。【方法】收集6例NFA和6例NP,应用miRCURYTM LNA基因芯片技术分析差异表达的miRNA,并应用荧光定量PCR对部分差异表达的miRNA进行验证。【结果】与正常标本相比,肿瘤标本中miR-124、-141、-200c、-223、-297、-299-5p、-32、-340、-378、-491-3p、-519d、-525-5p、-550、-551a、-574-5p、-583、-662、-768-3p、-885-5p、-890等20个miRNAs显著上调(上调到>2.0倍),miR-125b-1、-132、-17、-192、-193a-3p、-193a-5p、-21、-302c、-30b、-31、-376b、-490-5p、-542-3p、-567、-622、-637、-654-3p、-658等18个miRNAs明显下调(下调到0.5倍以下)。一些差异表达的miRNA参与细胞的增殖和凋亡过程,提示它们的变化可能与垂体腺瘤的发生发展有关。【结论】miRNAs表达的变化可能参与无功能垂体腺瘤的发生,而miRNAs靶基因的确立可以为无功能垂体腺瘤的发生机制提供新的理论依据。

灵芝孢子粉对去势大鼠内分泌功能的影响

目的:探讨灵芝孢子粉对去势大鼠内分泌功能的影响。方法:选用成年雌性SD大鼠进行双侧卵巢切除手术,术后采取灌胃法连续喂服灵芝孢子粉混悬液(实验组)或等量溶剂(实验对照组)。术后1、2、3或4周取血清,用放射免疫法检测血清中睾酮、雌二醇和卵泡刺激素的含量。术后4周取股骨和子宫作常规HE染色组织切片。结果:与正常对照组相比,实验对照组表现为血清内睾酮和雌二醇含量显著下降,股骨的骨密度显著减低,子宫内膜萎缩明显。与实验对照组相比,实验组血清中睾酮和雌二醇的含量显著提高;骨密度增大;子宫内膜萎缩程度降低。结论:灵芝孢子粉能显著改善去势大鼠的内分泌功能。

神经干细胞玻璃体内移植后的分化及对视网膜节细胞的影响

目的:观察视神经(ON)微挤压断后玻璃体内移植神经干细胞(NSCs)的分化情况及其对视网膜节细胞(RGCs)轴突再生的促进作用。方法:在成年大鼠球后1mm处微挤压断ON,在玻璃体内注入Hoechst33342标记的NSCs2×104个,实验动物分对照组(MC组、MC+PBS组)、实验组(MC+NSCs组),各组动物分别存活3、4、5周。用粒蓝逆行标记再生的RGCs,在荧光镜下观察视网膜平铺片再生RGCs的数量变化。另取实验组5只动物存活4周后取眼球切片观察NSCs分化情况。结果:存活3、4、5周,再生的RGCs数目实验组与对照组有显著差异(P<0.01)。4周后移植的NSCs表达NF、CNP、GFAP;未见NSCs迁移至视网膜内。结论:玻璃体内注入NSCs可显著促进ON微挤压断后RGCs轴突的再生,并在玻璃体内分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质样细胞。

ES细胞源性表皮干细胞在皮肤缺损创面的分化

目的探讨ES细胞源性表皮干细胞移植入小鼠全层皮肤缺损后对创面的修复作用,为组织工程皮肤的研究提供新的思路。方法将羊膜诱导后的带有核荧光标记的ES细胞源性表皮干细胞以生物膜为载体,覆盖小鼠全层皮肤缺损创面。术后1～8周连续取材,HE染色观察,苏丹Ⅲ染色,β1整合素、CK15、CK19、CEA免疫组化荧光双标观察。结果术后2周,创面完全长合,较厚的新生皮完全覆盖创面,基底层细胞增生,形成细胞柱伸向真皮层,真皮层中可见管腔样结构,4周后新生表皮开始变薄,新生表皮下可见毛囊样、汗腺样、皮脂腺样等结构,皮脂腺样结构苏丹Ⅲ染色阳性。免疫双标结果显示,1～4周新生表皮基底层细胞呈β1整合素、CK19阳性,真皮层中带有核标记的管状或泡状结构呈CK15、CEA阳性。结论ES细胞源性表皮干细胞在小鼠全层皮肤缺损创面可分化为表皮样、汗腺样、毛囊样和皮脂腺样等结构的潜能。

代谢综合征与血管重塑研究现状

代谢综合征是一组能引起心血管疾病的代谢紊乱症候群。由于其发病机制至今尚不清楚,防治难度极大。糖尿病高血糖、高血压机械力以及异常高的低密度脂蛋白血症是代谢综合征的三剑客,这不仅仅是因为三者同为代谢综合征的主要成分,更重要的是因为存在共同的发病基础。阐明它们之间如何发生协同作用的机制将可能成为防治代谢综合征的一个重大突破口。

机械牵张力和去甲肾上腺素协同激活小鼠血管平滑肌细胞α_1-肾上腺素能受体-ERK1/2信号促进细胞增殖

目的为证实α1-肾上腺素能受体(α1-AR)是否介导了机械牵张力和/或去甲肾上腺素(NE)对小鼠主动脉血管平滑肌细胞(VSMC)的细胞外信号调节激酶(ERK1/2)的协同激活并加速血管重构。方法静息培养的小鼠血管平滑肌细胞(VSMC)经有或无Prazosin(α1-AR抑制剂)预处理后,给予机械牵张力和/或NE刺激,Western Blotting检测ERK1/2的磷酸化水平,免疫荧光检测ki-67的表达(细胞增殖),RT-PCR检测细胞α1-AR亚型(α1A-,α1B-和α1D-AR)mRNA的表达。分别用三种亚型的α1-AR-siRNA预处理细胞,观察α1-AR各亚型基因沉默对机械牵张力诱导的VSMC ERK1/2磷酸化的影响。结果机械牵张力可分别上调α1B-和α1D-AR mRNA表达,但α1A-AR mRNA未检测到。机械牵张力和/或NE均可激活ERK1/2,引起ERK1/2磷酸化增加,而两种因素共同存在时ERK1/2激活更加明显;ki-67的表达呈现类似效应;这种由机械牵张力和/或NE激活的作用均可被Prazosin部分抑制。α1B-和α1D-AR-siRNA预处理可分别减少α1B-和α1D-AR mRNA的表达,进而相应地导致机械牵张力诱导的ERK1/2磷酸化的抑制。RT-PCR未能检测到经α1A-AR-siRNA预处理后的VSMC表达α1A-AR mRNA,但仍可见机械牵张力诱导的ERK1/2磷酸化被抑制。结论高血压机械牵张力和NE可协同促进VSMC ERK1/2激活及细胞增殖,导致血管重构加速;α1-AR部分介导了这一过程,α1-AR各亚型起着相似作用。本研究可望为深入探讨高血压异常机械力合并交感神经活性亢进协同促进血管重构的致病机制及防治新策略提供实验依据。

Hoechst33342与DAPI标记细胞核对胞内活性氧检测效果的比较

目的探讨Hoechst 33342与DAPI两种荧光染料标记细胞核后对细胞内活性氧水平的影响。方法静息培养的血管平滑肌细胞加入晚期糖基化终末产物作用10 min,加入标记活性氧的荧光探针H2DCFDA,再分别加入Hoechst 33342和DAPI不同荧光染料进行核标记。荧光显微镜下观察细胞核被标记的数目与细胞内活性氧的荧光水平。结果 Hoechst 33342染料标记5 min后即可见细胞核被标记上,随着时间的延长被标记的核数目并不发生改变;而与之明显不同的是,DAPI染料标记5 min时,只有几个细胞核被标记上,但随着时间的延长被标记的核数目越来越多。Hoechst 33342标记后细胞内活性氧的荧光强度并不随时间的延长发生变化,而DAPI标记后细胞内活性氧绿色荧光的细胞数就越少,DAPI标记的细胞核数与显示活性氧绿色荧光的细胞数呈反比。这些结果提示,DAPI染料在标记细胞核时破坏了活性氧在细胞内的储存,干扰了实验结果。结论检测细胞内活性氧时,应使用Hoechst 33342核标记染料而不能用DAPI。

苯甲酸钠诱导PC12细胞凋亡及对TH表达的影响

【目的】观察苯甲酸钠(SB)对PC12肾上腺嗜铬细胞瘤细胞凋亡的诱导作用及对酪氨酸羟化酶(TH)表达的影响。【方法】以大鼠PC12细胞为多巴胺能神经元细胞模型,以10～50 mmol/L不同浓度的SB加入PC12细胞,培养24 h后,噻唑蓝(MTT)比色法检测细胞活性;DAPI染色观察细胞凋亡形态;流式细胞术检测细胞凋亡状况以及用Western blot检测TH蛋白表达。【结果】SB可呈浓度依赖性抑制PC12细胞活性,并诱导PC12细胞核形态呈凋亡改变;流式细胞术检测显示随着SB浓度增加,细胞凋亡率显著增加;低浓度(10 mmol/L)SB作用下PC12细胞中TH表达增强,而高浓度(40～50 mmol/L)SB作用下TH表达减弱,同时,高浓度(40 mmol/L)SB作用下TH的表达减弱可呈时间依赖性。【结论】SB能够诱导PC12细胞凋亡,并伴随TH的表达改变。

三七总皂苷对心血管细胞信号转导影响的研究进展

三七总皂苷是中药三七的有效成分,它对于心血管细胞具有多方面的作用。在对心肌作用方面,三七总皂苷可降低不可逆性室颤发生,改善心脏舒缩功能,减少心肌缺血性损伤,对抗心肌肥大,抑制左心室重构;对内皮细胞作用主要表现在引起内皮细胞内游离钙离子浓度的增加,分泌NO1t-PA等,保护内皮;对血管平滑肌细胞,三七总皂苷具有抑制和促进细胞增生的双向作用。本文综述了近年来三七总皂苷对心血管细胞信号转导影响的研究进展。