神经组织工程技术治疗脊髓损伤的研究进展

严重的脊髓损伤(SCI)通常会引起损伤节段以下肢体感觉和运动丧失。作为目前难以治疗的疾病,SCI困扰着许多的患者。然而,神经组织工程技术为解决这一困境提供了许多新的治疗策略。与其他组织工程一样,神经组织工程也涉及到种子细胞、神经生长活性因子和生物支架材料三个方面。本文将就这三方面的最新研究进展逐一阐述,并着重介绍应用干细胞源性神经网络--外源性神经元中继器移植策略治疗脊髓损伤的研究工作,希望可以提供较为全面的神经组织工程技术治疗脊髓损伤研究概述。

神经干细胞与NT-3基因修饰雪旺细胞联合移植促进全横断脊髓损伤大鼠功能修复的实验研究

目的:探讨神经干细胞(NSCs)与神经营养素-3(NT-3)基因修饰雪旺细胞(SCs)联合移植对全横断脊髓损伤大鼠的后肢运动及神经传导功能修复的作用。方法:将NSCs与NT-3基因修饰SCs或未基因修饰SCs联合移植,或NSCs单独移植到大鼠全横断性脊髓损伤处,60d后进行爬网格测验和BBB评分检测运动功能。第67d,进行皮质运动诱发电位(CMEP)和皮质感觉诱发电位(CSEP)检测脊髓的神经传导功能。结果:脊髓损伤大鼠后肢的运动功能及CMEP和CSEP的修复程度依次为NSCs与NT-3基因修饰SCs联合移植组,NSCs与未基因修饰SCs联合移植组,NSCs单独移植组和实验对照组。结论:NSCs与NT-3基因修饰SCs联合移植能够促进脊髓损伤后大鼠的后肢运动及神经传导功能的修复。

督脉电针与神经干细胞移植联合应用促进SCI横断大鼠前角运动神经元存活及减轻后肢肌萎缩的研究

目的:探讨督脉电针与神经干细胞移植联合应用对大鼠脊髓全横断损伤的前角运动神经元存活以及减轻后肢肌萎缩有无促进作用。方法:将正常组、对照组、督脉电针组(电针组)、神经干细胞移植组(NSCs组)和督脉电针+神经干细胞移植组(电针NSCs组)成年大鼠T10脊髓段做全横断损伤,其中NSCs组和电针NSCs组在损伤处移植神经干细胞,电针组和电针NSCs组在术后开始接受督脉电针治疗。所有实验动物在脊髓损伤后存活65天。结果:电针NSCs组大鼠其腰段脊髓受损伤运动神经元的存活数量明显多于其他实验对照组大鼠。电针NSCs组大鼠后肢的股二头肌萎缩程度明显小于其他实验对照组大鼠。结论:督脉电针与神经干细胞移植联合应用能够促进大鼠脊髓全横断损伤后受损伤的脊髓前角运动神经元存活,以及减轻大鼠脊髓全横断损伤后瘫痪的后肢股二头肌的萎缩状况。

神经营养素-3基因修饰雪旺细胞和神经营养素-3受体基因修饰脊髓间充质干细胞联合移植促进脊髓损伤大鼠神经元存活的研究

目的:探讨神经营养素-3(NT-3)基因修饰雪旺细胞(SCs)和神经营养素-3受体(TrkC)基因修饰骨髓间充质干细胞(MSCs)联合移植对全横断脊髓损伤(SCI)大鼠的大脑皮质感觉运动区、红核和背核受损伤神经元存活的影响,为细胞治疗和基因治疗的临床应用提供依据。方法:将含有NT-3-SCs和TrkC-MSCs的PLGA高分子支架移植到大鼠脊髓全横断损伤处。在术后第67天,取其大脑和脊髓进行冷冻切片。用免疫荧光组织化学染色方法,检测SCI处SCs和MSCs的存活及其外源性基因的表达,并计算大脑皮质感觉运动区内锥体细胞层、中脑红核和L1脊髓背核的神经元数量。结果:2个月后,可见SCI处有移植的SCs和MSCs,其中转染的外源性基因NT-3和TrkC可在移植细胞内表达。NT-3-SCs+TrkC-MSCs移植组大脑皮质感觉运动区内锥体细胞层、中脑红核和L1脊髓背核的神经元数量明显高于其他组。结论:NT-3基因修饰SCs和TrkC基因修饰MSCs联合移植能够促进全横断SCI大鼠的大脑皮质感觉运动区、中脑红核和脊髓背核受损伤神经元的存活。

NT-3基因修饰及维甲酸预诱导的骨髓间充质干细胞在脊髓损伤处分化为神经元样细胞的研究

目的探讨移植在脊髓损伤处的神经营养素-3(NT-3)基因修饰及维甲酸(RA)预诱导的骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为神经元样细胞的潜能。方法将MSCs、RA诱导的MSCs、LacZ基因修饰的MSCs、NT-3基因修饰的MSCs和NT-3基因修饰及RA预诱导的MSCs分别立即移植到脊髓全横断处(T10脊髓),术后67d取材和冷冻切片,用免疫荧光组织化学染色方法检测MSCs的分化潜能,计算各细胞移植组脊髓损伤处的MSCs分化为神经元样细胞的百分率。结果移植的MSCs在受损伤的脊髓内可分化为神经干细胞(nestin阳性)、神经胶质样细胞(GFAP阳性)和神经元样细胞(NF和MAP2阳性),有些还可以向含有某种神经递质和有形成突触潜能的神经元样细胞分化(ChAT、5-HT和PSD95阳性)。联合应用NT-3基因修饰和RA预诱导的MSCs能在受损伤的脊髓内更有效地提高MSCs向神经元样细胞分化的百分率。结论NT-3基因修饰和RA预诱导的MSCs能在脊髓损伤处更好地分化为神经元样细胞。

灵芝孢子在降低维甲酸诱导胚胎小鼠发生神经管畸形过程中对Cdk4表达的影响

目的探讨灵芝孢子在降低维甲酸诱导胚胎小鼠发生神经管畸形过程中对依赖细胞周期蛋白激酶4(Cdk4)表达的影响。方法给予实验对照组和灵芝孢子组妊娠E7.75d的小鼠一次性胃饲维甲酸,造成这2组孕鼠的胚胎出现神经管畸形。然后,给予灵芝孢子组孕鼠胃饲灵芝孢子溶液。在孕期E10.5d时取出2组孕鼠的胚胎,应用免疫荧光组织化学染色和Western blotting检测胚胎神经管神经上皮依赖细胞周期蛋白激酶4(Cdk4)的表达情况。结果在灵芝孢子组可以观察到形态正常的胚胎中,神经管的神经上皮细胞有Cdk4的表达,其表达水平与空白对照组及正常对照组相比较没有明显差异。在灵芝孢子组形态异常的胚胎中,其神经管的神经上皮细胞也有Cdk4的表达,但其表达水平与空白对照组及正常对照组相比较是低的。结论灵芝孢子可能是通过促进神经管神经上皮细胞上调Cdk4的表达来减轻维甲酸诱导的胚胎小鼠神经管畸形。

聚左旋丙交酯纳米纤维支架与大鼠脊髓组织相容性的研究

目的探讨聚左旋丙交酯[Poly(l-lactic acid),PLLA]纳米纤维支架与大鼠脊髓组织的相容性。方法以PLLA为原料,采用液-液相分离技术构建纳米纤维支架(Nanofibrous scaffolds)。在体外构建骨髓间充质干细胞(MSCs)-PLLA纳米纤维支架复合体;将12只SD大鼠随机分为两组,即损伤对照组和MSCs移植组。暴露大鼠胸10脊髓段做半横断损伤,其中在损伤对照组脊髓损伤处移植PLLA纳米纤维支架,在MSCs移植组脊髓损伤处移植MSCs-PLLA纳米纤维支架复合体。术后两组动物观察60d。HE染色观察结构改变,免疫组织化学方法观察炎症细胞及MSCs的存活情况。结果体外成功构建MSCs-PLLA纳米纤维支架复合体。扫描电镜显示,PLLA纳米纤维支架由相互贯穿的微孔组成。荧光显微镜和扫描电镜下均可见MSCs能够很好地黏附在支架上,分布较均匀。移植术后60d,HE染色显示,PLLA纳米纤维支架与脊髓组织融合较好,无明显空洞和瘢痕。CD68免疫组织化学显示,在移植物与宿主脊髓交界处有少量阳性细胞,表明有轻微炎症反应。GFP免疫组织化学显示,移植在脊髓损伤处的PLLA纳米纤维支架内有大量阳性MSCs,表明MSCs在移植术60d仍有存活。结论PLLA纳米纤维支架与大鼠脊髓组织有较好的生物相容性。

灵芝孢子促进大鼠受损伤脊髓运动神经元存活及其轴突再生相关蛋白质组学的初步研究

目的:寻找与灵芝孢子促进受损伤脊髓运动神经元存活及其轴突再生相关的蛋白质。方法:SD大鼠随机分为正常对照组、模型组和灵芝孢子治疗组。模型组和灵芝孢子治疗组大鼠行脊神经腹根切断术。灵芝孢子治疗组大鼠胃饲灵芝孢子14 d。取各组大鼠脊髓灰质组织蛋白质,行双向电泳,采用基质辅助激光解吸离子化飞行时间质谱仪鉴定各组之间有明显差异表达的蛋白质。结果:各组之间共有6种蛋白质的表达存在差异,分别是塌陷反应介导蛋白2(collapsin response mediator protein 2,CRMP-2)、纤维型肌动蛋白加帽蛋白β(F-actin capping protein beta subunit,FCP-β)、异柠檬酸脱氢酶β(isocitrate dehydrogenase[NAD]subunit beta,IDH-β)、三磷酸腺苷酶(ATPase)、谷氨酸草酰乙酸氨基转移酶1(glutamate oxaloace-tate transaminase-1,GOT1)和丙酮酸激酶-M2(M2 pyruvate kinase,M2-PK)。灵芝孢子治疗组CRMP-2、IDH-β、ATPase和GOT1的表达高于模型组,而FCP-β和M2-PK的表达则低于模型组。结论:灵芝孢子可能通过上调或下调上述蛋白质的表达,参与促进大鼠受损伤脊髓运动神经元存活及其轴突再生作用。

预先服用灵芝孢子降低维甲酸诱导的孕鼠胚胎神经管畸形发生率

目的探讨预先服用灵芝孢子能否降低维甲酸诱导的胚胎神经管畸形的发生率。方法将胚胎(embryo,E)0d孕鼠随机分为正常对照组、溶剂组、模型组和灵芝孢子组,每组5只。灵芝孢子组孕鼠于E0d起即给予胃饲灵芝孢子溶液,溶剂组孕鼠胃饲等量溶剂。至E7.75d时,模型组和灵芝孢子组孕鼠一次性胃饲全反式维甲酸。E10.5d时取孕鼠胚胎,计算神经管畸形发生率及测量胚胎顶臀距。采用免疫荧光组织化学染色和流式细胞术检测胚胎神经管神经上皮细胞巢蛋白的表达及细胞周期分布,采用DNA定量荧光染色及RT-PCR技术检测胚胎神经管细胞周期素依赖性蛋白激酶2(cyclin-dependentkinase2,Cdk2)和Cdk4mRNA的转录水平。结果孕鼠胚胎神经管畸形发生率模型组为79.41%,灵芝孢子组为21.67%;顶臀距模型组为(3.62±1.27)mm,灵芝孢子组为(5.84±0.92)mm。胚胎神经管神经上皮细胞巢蛋白表达阳性率模型组为32.44%,灵芝孢子组为77.65%。模型组孕鼠胚胎神经管神经上皮细胞G0/G1期比例为82.80%,灵芝孢子组为53.74%。灵芝孢子组Cdk4mRNA转录水平高于正常对照组和溶剂组,但未检测到Cdk2mRNA。结论预先服用灵芝孢子能够降低维甲酸诱导的孕鼠胚胎神经管畸形的发生率。

神经营养素-3基因修饰骨髓间充质干细胞的明胶海绵圆柱体支架移植促进大鼠全横断脊髓损伤部分结构和功能修复的研究

目的:探讨神经营养素-3(NT-3)基因修饰骨髓间充质干细胞(MSCs)的明胶海绵圆柱体支架移植对大鼠全横断脊髓损伤部分结构和功能修复的影响。方法:选取15只SD大鼠,随机分成3组:①NT-3基因修饰MSCs联合明胶海绵圆柱体支架移植组(NT-3-MSCs组);②MSCs联合明胶海绵圆柱体支架移植组(MSCs组);③单纯明胶海绵圆柱体支架移植组(control组)。在脊髓全横断后施行上述支架移植,在一定时间点比较3组动物功能恢复情况及其脊髓损伤区的结构变化。结果:NT-3-MSCs组BBB功能评分、移植的MSCs存活数、神经丝蛋白-200(NF-200)阳性纤维计数和平均空洞面积均优于其余组别(P<0.05)。结论:NT-3基因修饰MSCs联合明胶海绵圆柱体支架移植能够促进大鼠脊髓损伤部分结构和功能的修复,为临床治疗脊髓损伤提供实验依据。

灵芝孢子在预防维甲酸诱导胚胎小鼠发生神经管畸形过程中对Cdk4表达的影响

目的探讨预先服用灵芝孢子在降低维甲酸诱导胚胎小鼠发生神经管畸形过程中对依赖细胞周期蛋白激酶4(cyclindependentproteinkinase4,Cdk4)表达的影响。方法于孕期小鼠E0d时给予灵芝孢子组的孕鼠胃饲灵芝孢子溶液,8g·kg-1·d-1。实验对照组的孕鼠胃饲等量溶剂。于E7.75d时,两组孕鼠一次性胃饲维甲酸,剂量为50mg/kg体重。正常对照组孕鼠胃饲等量灵芝孢子溶剂,但是在E7.75d时,仅给予维甲酸溶剂。空白对照组孕鼠常规饲养不作任何处理。在孕期E10.5d时取出4组孕鼠的胚胎,应用免疫荧光组织化学染色和Westernblot检测胚胎神经管神经上皮Cdk4表达情况。结果实验对照组孕鼠胚胎神经管神经上皮细胞Cdk4的表达明显降低,而灵芝孢子组胚胎表达Cdk4的强度明显高于实验对照组。正常对照组与空白对照组相比Cdk4的表达无统计学意义(P>0.05)。结论灵芝孢子可能是通过增强神经管神经上皮细胞表达Cdk4降低维甲酸诱导胚胎小鼠神经管畸形的发生。

红景天对慢性应激导致的抑郁大鼠大脑海马5-羟色胺水平及其细胞增殖、分化和神经元数量的影响

目的:探讨中药红景天Rhodiola rosea对慢性应激导致的抑郁大鼠大脑海马5-羟色胺(5-HT)水平及其细胞增殖、分化和神经元数量的影响。方法:50只大鼠被分为正常对照组、模型组、阴性对照组、阳性对照组及红景天治疗组,每组各10只动物。除正常对照组外,给予其余4组大鼠为期4周的慢性应激,以建立抑郁症模型。在模型建立后,除模型组正常饲养外,其余4组大鼠分别灌服5%羧甲基纤维素钠、氟西汀、红景天,灌药周期均为3周。灌药结束后,采用高效液相色谱法检测海马组织5-HT水平,5-溴脱氧尿嘧啶(BrdU)和β-微管蛋白Ⅲ(β-tubu-linⅢ)免疫荧光组化双标记染色检测海马神经干细胞的增殖和分化、采取形态计量学方法计数海马神经元。结果:与正常对照组比较,红景天治疗组的大脑海马5-HT水平、BrdU标记细胞数量、β-tubulin III和BrdU双标记细胞百分率以及神经元数量恢复性增加到正常对照组大鼠的水平。结论:红景天能够提高慢性应激导致的抑郁大鼠大脑海马5-HT水平,促进其海马神经干细胞增殖和分化,同时具有保护受损伤的海马神经元的作用。

督脉电针与神经干细胞移植联合应用促进脊髓全横断大鼠受损伤的神经元存活及其轴突再生

目的探讨督脉电针与神经干细胞移植联合应用对脊髓全横断大鼠受损伤的神经元存活及其轴突再生的影响。方法将对照组、神经干细胞移植组、督脉电针组和督脉电针+神经干细胞移植组的成年大鼠胸10脊髓段做全横断损伤;其中神经干细胞移植组和电针神经干细胞组在损伤处移植神经干细胞。电针组和电针神经干细胞移植组在术后开始接受督脉电针治疗。所有动物存活67d。结果1.电针神经干细胞移植组脊髓损伤处的去甲肾上腺素能5、_羟色胺受体、降钙素基因相关肽能和生长相关蛋白-43阳性染色的4种神经纤维均明显多于其他几组。2.电镜下可观察到脊髓横断处有再生的神经纤维穿越,在电针神经干细胞移植组尤为明显。3.大脑体感运动区皮质和中脑红核受损伤的神经元存活数量也多于其他几组,一些神经元的再生神经纤维可能穿越横断处,进入尾端脊髓组织。结论督脉电针与神经干细胞移植联合应用能促进脊髓全横断大鼠受损伤的神经元存活及其轴突再生。

督脉电针与夹脊电针对受损伤的大鼠脊髓背核神经元存活及其NOS表达的影响比较

目的比较督脉电针和夹脊电针对受损伤的脊髓背核神经元存活及其表达NOS的影响。方法将10只SD雌性大鼠(180—200g)分为督脉电针组和夹脊电针组。将两组动物制备全横断脊髓损伤模型,术后第5d进行电针治疗,一组行督脉电针治疗,另一组行夹脊电针治疗。电针治疗30d后,将两组动物灌注、固定和取材,冰冻切片,做NADPH-黄递酶组织化学染色检测脊髓背核神经元一氧化氮合酶(NOS)的活性。分别计数L1脊髓背核存活神经元数目及其表达NOS神经元数。结果督脉电针组L1脊髓背核存活神经元数目是218.50±7.23,表达NOS的神经元数是8.20±0.82,夹脊电针组L1脊髓背核存活神经元数目是188.60±6.48,表达NOS的神经元数是17.80±1.79。督脉电针组L1脊髓背核存活神经元数目多于夹脊电针组(P<0.05),并且督脉电针组L1脊髓背核表达NOS的神经元数明显少于夹脊电针组(P<0.05)。结论督脉电针比夹脊电针能够更好地促进受损伤的脊髓背核神经元存活以及抑制受损伤的脊髓背核神经元表达NOS。

缬草对慢性应激导致的抑郁大鼠大脑海马5-羟色胺水平、细胞增殖及神经元数量的影响

目的:探讨缬草对慢性应激导致的抑郁大鼠大脑海马5-羟色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)水平、细胞增殖及神经元数量的影响。方法:70只大鼠被分成正常对照组、未用药模型组、阴性对照模型组、阳性对照模型组和低、中、高剂量缬草治疗组,每组10只。除正常对照组外,给予其余6组大鼠4周慢性应激建立抑郁症模型。除未用药模型组大鼠正常饲养外,其余6组大鼠在模型建立后分别灌服5%羧甲基纤维素钠、氟西汀以及低、中、高剂量缬草,灌药周期均为3周。灌药结束后,体内注射5-溴脱氧尿嘧啶核苷(bromodeoxyuridine,BrdU)标记海马增殖细胞,应用高效液相色谱法检测海马组织5-羟色胺水平,采用形态计量学方法计数海马神经元数量。结果:与正常对照组比较,低、中剂量缬草治疗组的海马5-HT含量增加,并恢复至正常水平。灌服低剂量缬草3周后,抑郁大鼠海马BrdU阳性细胞数目和神经元数量恢复性增加至正常对照组大鼠的水平。结论:小剂量缬草能够促进抑郁大鼠大脑海马5-HT水平及细胞增殖数量恢复至正常状况,同时具有保护海马受损伤神经元的作用。

不同局部穴位电针对大鼠受损伤脊髓组织降钙素基因相关肽表达的影响

目的:观察不同局部穴位电针对大鼠受损伤脊髓组织降钙素基因相关肽CGRP表达和分布的影响。方法:将25只SD大鼠分为5组:正常对照组、脊髓损伤组、非穴位电针组、夹脊穴电针组和督脉穴电针组。在显微镜下予脊髓全横断术(正常对照组除外),自术后第7天分别采用局部选取电针非穴位、电针夹脊穴和电针督脉穴的方法治疗3d(脊髓损伤组不予任何治疗),取材并以免疫荧光组织化学染色的方法观察脊髓背角CGRP阳性染色区面积变化,用蛋白免疫印迹杂交法检测脊髓CGRP含量变化。结果:非穴位电针组和夹脊穴电针组的脊髓背角CGRP含量与脊髓损伤组比较,均有所升高(P<0.05),但其CGRP阳性染色区面积没有明显差异(P>0.05)。督脉穴电针组的脊髓背角CGRP含量和CGRP阳性染色区面积与非穴位电针组、夹脊穴电针组和脊髓损伤组比较,有明显增高、增大(P<0.05)。结论:不同局部穴位电针对大鼠受损伤脊髓组织表达CGRP有不同的影响,其中督脉穴电针能够明显促进大鼠受损伤脊髓组织表达CGRP。

督脉电针与NSCs移植联合应用对大鼠脊髓全横断损伤组织NT-3含量及受体表达的影响

目的:探讨督脉电针与神经干细胞(NSCs)联合应用对大鼠脊髓全横断损伤组织神经营养素-3(NT-3)含量及其受体表达的影响。方法:将30只成年大鼠分为对照14d组、督脉电针14d组(电针14d组)、神经干细胞移植14d组(NSCs14d组)、督脉电针+神经干细胞移植14d组(电针NSCs14d组)、神经干细胞移植30d组(NSCs30d组)和督脉电针+神经干细胞移植30d组(电针NSCs30d组)6组,所有动物均实施T10段脊髓全横断手术,其中电针组和电针NSCs组于术后5d进行电针治疗。结果:①电针NSCs14d组受损伤的脊髓组织含有较高水平的NT-3,其次是电针14d组和NSCs14d组,对照14d组受损伤的脊髓组织含有较低水平的NT-3。②NSCs30d组和电针NSCs30d组脊髓全横断处的移植神经干细胞均有TrkC表达。结论:督脉电针与神经干细胞移植联合应用能够明显增高大鼠脊髓全横断损伤处邻近组织的NT-3水平;在大鼠脊髓损伤处及邻近组织有些移植神经干细胞表达TrkC。

体外培养的嗅鞘细胞能够促进骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞

目的探讨体外培养的嗅鞘细胞(OECs)对骨髓间充质干细胞(MSCs)分化的影响。方法实验分为OECs+MSCs共培养组和MSCs单独培养组,在7d和14d两时间点观察MSCs的分化情况。用p75抗体免疫细胞化学染色鉴定OECs细胞的纯度;用巢蛋白(nestin)、神经丝蛋白(NF)、微管相关蛋白2(MAP2)、胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)、突触后膜致密区蛋白(PSD)等抗体免疫细胞化学染色鉴定已分化的细胞表型。结果体外培养的MSCs经OECs诱导后分化为神经元样细胞,这些细胞能够表达NF、MAP2和PSD等神经元标记物,而不表达星形胶质细胞标记物GFAP。在培养7d,MSCs+OECs7d组的MSCs分化为神经元样细胞的百分率与MSCs7d组比较有明显增高。在培养14d,MSCs+OECs14d组的MSCs分化为神经元样细胞的百分率与MSCs14d组比较,也有明显增高。结论体外培养的嗅鞘细胞能够促进骨髓间充质干细胞分化为神经元样细胞。

NT-3基因修饰施万细胞促进神经干细胞体外分化为神经元样细胞

目的观测神经营养素-3(NT-3)基因修饰施万细胞(SCs)对神经干细胞体外分化为神经元样细胞的影响。方法神经干细胞(NSCs)分别与NT-3基因修饰SCs(NT-3-SCs)、LacZ基因基因修饰SCs(LacZ-SCs)和SCs在体外共培养,7d后用免疫组化方法观测NSCs的分化并计算其中神经元样细胞的分化率。结果NSCs在体外可分化为神经元样细胞(NF阳性)和神经胶质样细胞(GFAP阳性),与未基因修饰的SCs相比,NT-3-SCs能更有效地提高神经元样细胞的分化率,而LacZ-SCs与SCs没有明显区别。结论NT-3-SCs能促进NSCs向神经元样细胞分化。